2.4 Gangliosid-Analytik
2.4.3 D¨unnschichtchromatographie (HPTLC)
Tabelle 2.8: Referenzsubstanzen f¨ur die HPTLC.
Standard Herkunft Bezeichnung
IV3Neu5Ac,III3Fuc-nLc4 synthetisch JM07/95
HBG Hirn Ganglioside (Mensch) HD01/113-a
HGG Granulozyten Ganglioside (Mensch) JM07/7-1
St¨arkehydrolysat Kartoffel SKE02/192-1
Cer(OH) Typ IV, aus Hirn (Rind) C-2512
Cer Typ III, aus Hirn (Rind) C-2137
der Banden des HPTLC-getrennten St¨arkehydrolysates erfolgte nachW¨ursch&
Roulet (1982).
2.4.3.1 HPTLC-Platten
Die verwendeten HPTLC-Platten sind Fertigplatten aus Glas24der Gr¨oße 10 cm×
10 cm, beschichtet mit Kieselgel-60 in 0,2 mm Dicke.
Um eine hohe Reproduzierbarkeit zu gew¨ahrleisten, wurden die HPTLC-Platten zur Entfernung von Restwasser f¨ur einen Zeitraum von 40 min auf 120◦C erhitzt25, danach in einen mit frischem Trockenmittel26 ausgestatteten Exsikkator gegeben und dort langsam auf Raumtemperatur abgek¨uhlt. Die so aktivierten Platten verblieben bis zur Applikation der Proben im Exsikkator.
2.4.3.2 Probenapplikation
Die Auftragung der GSL erfolgte halbautomatisch mit den Applikatoren Lino-mat IV27 und AS3028 mit einer Geschwindigkeit von 5 sec/µL bis 15 sec/µL in Banden von 5 mm Applikationsbreite und 1 cm Distanz zur unteren Plattenkante.
Die Applikation der Gangliosidproben f¨ur die pr¨aparative HPTLC wurde in einem Konzentrationsbereich von 0,1 ng/mm bis maximal 3 µg/mm durchgef¨uhrt, da es bei einer weiteren Erh¨ohung der Auftragsmenge zu einer ¨Uberbeladung der HPTLC Platte kommt. Die Proben wurden dementsprechend als 80 mm breite Banden mit dem Linomat IV appliziert.
2.4.3.3 HPTL-Chromatographie
Um eine optimale Auftrennung von Gangliosiden, Oligosacchariden und Cerami-den zu erreichen, wurCerami-den die Proben in Cerami-den in Tabelle 2.9 angegebenen Laufmit-teln chromatographiert.
F¨ur die Chromatographie wurden die HPTLC-Platten in Metallst¨andern verti-kal in die Trogkammern eingebracht, die vor Beginn der Entwicklung mit der Dampfphase des Laufmittels ges¨attigt wurden. Um eine optimale ¨Aquilibrierung zu gew¨ahrleisten, wurden die 2-L-Kammersysteme mit Filterpapier29 U-f¨ormig ausgekleidet und mit 100 mL Laufmittel ¨uber Nacht inkubiert. Ein Entweichen
24Art.-Nr. 5633, E. Merck GmbH, Darmstadt, D
25Inkubator, Gebr. Rettenberg GmbH, G¨ottingen, D
26P2O5 mit Feuchtigkeitsindikator, Art.-Nr. P 0679
27CAMAG, Muttenz, CH
28Desaga GmbH, Heidelberg, D
29Chromatographie Papier, 3 mm×190 mm×400 mm, Art.-Nr. 3030690, Whatman International Ltd., Maidstone, UK
Tabelle 2.9: Ubersicht der Zusammensetzung der verwendeten HPTLC Laufmittel¨ (LM) und ihrer Chromatographiezeiten.
Probe Zeit [min] Abk¨urzung Zusammensetzung
Ganglioside 25 LM 1 C/M/W (120/85/20)
mit 2 mM CaCl2a
Ganglioside 1. 25 LM 1
(Methode f¨ur 2. 140 LM Db n-Prop/W (2/1)
die 2D-HPTLC) mit 11,3 M NH3a
polare Ganglioside 30 LM 2 C/M/W (50/47/14)
mit 5 mM CaCl2a
Oligosaccharide 1. 40 LM A n-Prop/A/W (45/30/25) 2. 40 LM B n-Prop/A/W (50/47/10)
Ceramide 25 LM C C/M (90/10)
Die Mengenverh¨altnisse sind in Volumeneinheiten angegeben. Zwischen zwei aufeinander-folgenden Chromatographie-L¨aufen (1.und2.) wurden die HPTL-Chromatogramme f¨ur 30 min unter ¨Olpumpenvakuum getrocknet.aEndkonzentration im Laufmittel,bf¨ur 2D-HPTLC nachWiesner &Sweeley (1995) mit Prop: Propanol, A: Aceton.
leicht fl¨uchtiger Laufmittelkomponenten wurde durch ein Gewicht von 4 kg auf dem Kammerdeckel verhindert.
Die Aufbewahrung der HPTL-Chromatogramme erfolgte ¨uber einen kurzen Zeit-raum im Exsikkator, die Langzeitlagerung wurde bei -20◦C nach Verpackung in Zellstoff/Aluminiumfolie oder eingeschweißt in Kunststoffolie durchgef¨uhrt. Dies minimiert den Kontakt der getrennten GSL auf der HPTLC-Platte mit der Luft.
Untersuchungen mit Ozon haben gezeigt, daß selbst Spuren dieses Gases unter normalen Bedingungen in wenigen Stunden dazu in der Lage sind, Glykolipide zu oxidieren und ihren Nachweis zu st¨oren (Jennemann et al., 1997).
2.4.3.4 Gangliosid-Detektion
Um Molek¨ulgruppen der HPTLC-getrennten Ganglioside zu detektieren, wurden verschiedene Spr¨uhreagenzien auf die durch Abdampfen vom Laufmittel befreiten
Tabelle 2.10: Spr¨uhreagenzien und Durchf¨uhrung der Entwicklungen zur Detektion d¨unnschichtchromatographisch getrennter Ganglioside und Ceramide.
Farbstoff Spr¨uhl¨osung Entwicklung Detektion Orcin 0,2% in 3 M H2SO4 10 min, 100◦C 550 nm
3,5-Dihydroxy-toluol
Resorcin 0,2% in H2O/HClkonz. 15 minb, 100◦C 580 nm 1,3-Benzyldiol (2/8)a
Anisaldehyd 0,5% in 10 min, 100◦C 560 nm
4-Methoxybenz- M/HOAc/H2SO4,konz.
aldehyd (85/10/8)
NBD 0,003% in Aceton −c 366 nm
4-(N,N-Dihexadecyl-) amino-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol
amit 0,25 mM CuSO4(aq.) (250µL einer 100 mM w¨aßrigen Stamml¨osung auf 100 mL),
babgedeckt mit einer Glasplatte, ckann direkt unter UV-Licht detektiert werden.
Chromatogramme gegeben. Dazu wurde die HPTLC-Platte in einem Abzug mit feinem Reagenziennebel (Druckluftbetrieb) m¨aanderf¨ormig bespr¨uht. Tabelle 2.10 gibt eine ¨Ubersicht der Reagenzien sowie eine Methodenbeschreibung f¨ur die Ver-wendung von Orcin30, Resorcin31 und Anisaldehyd32 nachJork et al. (1989).
F¨ur die zerst¨orungsfreie Detektion der getrennten Ganglioside und ihre Isolie-rung mittels pr¨aparativer D¨unnschichtchromatographie wurden die fließmittel-freien Chromatogramme mit dem Fluoreszenzfarbstoff NBD33 nach M¨uthing
& Unland (1992) bespr¨uht. Hierbei lagert sich der Farbstoff mit seinen lan-gen Kohlenwasserstoffketten in den Chromatogrammzonen mit hohem Anteil an Alkanketten an und kann zudem mit seiner Nitrogruppe elektrostatische Wech-selwirkungen zu geladenen Kopfgruppen der Ganglioside ausbilden.
Das Nachweisreagenz f¨ur Kohlenhydrate auf der D¨unnschichtchromatographie-platte ist eine Orcin/Schwefels¨aure-L¨osung. Die F¨arbung erfolgt nach Applika-tion des Farbstoffs und Entwicklung der Chromatogramme bei 100◦C. Es werden
30Art.-Nr. 820933
31Art.-Nr. 7590
32Art.-Nr. 10440
33Art.-Nr. D-69, Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA
violett-bragef¨arbte Banden auf beige-farbenem Untergrund sichtbar. Bei un-zureichender F¨arbung kann der Vorgang wiederholt werden.
F¨ur den spezifischen Nachweis von Sialins¨auren hat sich eine Resorcin /HCl-L¨osung bew¨ahrt. Hierzu wird auf das Chromatogramm zur intensiveren Einwir-kung der salzsauren L¨osung (Schutz vor schneller Verdunstung) w¨ahrend der min-destens 15 min¨utigen Entwicklungszeit bei 100◦C eine Glasplatte mit Metallklam-mern fest auf das Silikat gepreßt. Die fertige F¨arbung zeigt rot-braune Banden auf beige-farbenem Grund.
Zur Detektion von Ceramiden wurde eine Anisaldehyd/Schwefels¨aure-L¨osung34 verwendet. Dieses Universalreagenz f¨ur Naturstoffe aller Art erm¨oglicht durch Farbdifferenzierung den Nachweis unterschiedlicher Substanzen. Die Entwicklung erfolgt bei 100◦C f¨ur 10 min und f¨uhrt bei Ceramiden zu pink-violetten Banden auf rosa-farbenem Untergrund.
2.4.3.5 Densitogramme von HPTL-Chromatogrammen durch Auflichtscann-Verfahren
Zur quantitativen Bestimmung der Bandenintensit¨aten der HPTL-Chromato-gramme wurden zwei Methoden eingesetzt, mit denen auf unterschiedliche Weise Densitogramme der chromatographisch getrennten Gangliosidmischungen erhal-ten werden konnerhal-ten. Die Sialins¨aure Neu5Ac wurde auf Referenzplaterhal-ten in unter-schiedlichen Konzentrationen appliziert und dann mit den beiden im Folgenden beschriebenen Methoden quantifiziert.
HP ScanJet 4c mit WinCam-Auswertung
Die Aufnahme der Densitogramme von den HPTLC-getrennten Gangliosiden und der Sialins¨aure erfolgte mit einem PC-gesteuerten HP ScanJet 4c Scanner mit der Software DeskScan II.35 Eine Quantifizierung der Chromatogramme und die an-schließenden Auswertungen wurden mit dem Programm WinCam V2.236 durch-gef¨uhrt.
34Art.-Nr. 00199
35Scanner: HP ScanJet 4c, Software: V2.3, Hewlett-Packard & Co., USA
36Cybertech, Berlin, D
Desaga Densitometer CD60 im Remissionsmodus
Im Vergleich zur soeben beschriebenen Methode wurden die HPTLC-Platten mit dem Densitometer CD6037 vermessen. Die Chromatogramme wurden bei dieser Methode mit monochromatischem Licht angeregt und die Remission wurde detek-tiert (Anregungswellenl¨angen siehe Tabelle 2.10). Die Auswertung der Meßdaten erfolgte PC-gest¨utzt mit der integrierten Software der Firma Desaga.