Die Identifizierung des Gens modB7-2

Element entfernt wurde. Auf diese Weise ist die Identifizierung von in Kooperation arbeitenden Genen sichergestellt, da auch der Ausfall eines Kooperationspartners bereits einen Einfluss auf den Phänotyp haben sollte. Die Vorteile gegenüber der Transposonbibliothek bestehen einerseits in der geringen Anzahl von der zu screenenden Mutanten und andererseits in dem genauen Wissen um die Lokalisierung der Deletionen. Sollte ein Phänotyp von Interesse mit den Mutanten nicht abgedeckt werden, also keine der verwendeten MCMV-Deletionsmutanten einen Loss-of-Function-Phänotyp zeigen, bietet diese Bibliothek eine zuverlässige Information darüber, wo das gesuchte Gen nicht lokalisiert sein kann. Eine solche Information kann durch das Screening der Transposonbibliothek nicht ermittelt werden.

angrenzenden ORFs m149 erstreckte. Sollten zwei dieser Gene in Abhängigkeit voneinander für die Herunterregulierung von CD86 verantwortlich sein, müssten diese bei einer Koinfektion und somit einer Bereitstellung der Genprotukte in Trans ein Gain-of-Function-Phänotyp zu beobachten sein. Dies war jedoch nicht der Fall, was ein deutlicher Hinweis darauf war, dass der beobachtete Phänotyp nicht durch die Kooperation der Gene m147/m148 und m149 hervorgerufen wurde. Diese Ergebnisse können lediglich als Hinweis verstanden werden, da beide Virusmutanten ein GFP-Gen tragen und somit keine Möglichkeit bestand, eine Koinfektion tatsächlich nachzuweisen.

Es wurde jedoch in diesem Versuch eine hohe Infektionsdosis eingesetzt und davon ausgegangen, dass zumindest in einem Anteil von Zellen eine Infektion mit beiden Viren stattgefunden haben musste.

Lediglich eine Beteiligung des ORFs m150 konnte an dieser Stelle ausgeschlossen werden. Diese Untersuchungen machten deutlich, dass das gesuchte Gen nicht mit nur einem der vorhergesagten ORFs übereinstimmte oder durch die kooperative Wirkung zweier ORFs hervorgerufen wurde. Tatsächlich war ein zusammenhängender Bereich, der die Gene m147/m148 und m149 umfasste, für die Herunterregulierung von CD86 essentiell.

Das Ergebnis dieser Untersuchungen war ein deutlicher Hinweis auf die zweite genannte Möglichkeit, nämlich dass innerhalb der Region ein Gen kodiert wird, welches mit keinem der vorhergesagten ORFs übereinstimmt und sich über den gesamten Bereich erstreckt. Um die für den Effekt essentiellen Sequenzen innerhalb der Kandidatenregion weiter einzugrenzen, wurden sehr kleine Deletionen an verschiedene Stellen platziert, in die eine FRT-Stelle inseriert wurde. Diese Veränderungen waren im Gegensatz zu allen vorher hergestellten Mutanten nur geringfügig und sollten somit nur einen sehr lokalen Effekt haben. Mit diesen Mutanten wurden essentielle Regionen im Bereich der Gene m147/m148 und m149 identifiziert. Hierfür wurde eine kleine Deletion im Bereich des ATG von m147 gesetzt, die ebenfalls das ATG des auf dem Gegenstrang kodierten m149 umfasste. In dieser Mutante ist von den drei in Frage kommenden ORFs nur der ORF m148 vollständig. Die Tatsache, dass diese Mutante einen Wildtypphänotyp aufwies belegte, dass weder der vorhergesagte ORF m147 noch der ORF m149 für den Effekt verantwortlich sind. Da jedoch mit Hilfe der weiteren Mutanten essentielle Regionen im Bereich der ORFs m147/m148 und m149 identifiziert

wurden, wurde deutlich, dass zwar der vollständige ORF m149 für die Funktion nicht notwendig ist, aber Sequenzen innerhalb des ORFs dies durchaus sind.

Mit den Northern Blot-Analysen wurde nur ein Transkript der Größe von 0,7 kb nachgewiesen, obwohl zwei Sonden verwendet wurden, die zu Bereichen der ORFs m147/m148 und m149 komplementär waren. Da das detektierte Signal in beiden Fällen die gleiche Größe hatte, deutete dies darauf hin, dass innerhalb der von den Sonden abgedeckten Region nur eine einziges transkript gebildet wird, das sich über diesen Bereich erstreckt. Eine andere Möglichkeit war diejenige, dass dort zwei nahezu gleich grosse mRNA´s kodiert werden, die beide zum Untersuchungszeitpunkt exprimiert werden. Die RT-PCR-Analyse bewies die Existenz eines gespleißten Gens, welches sich über die genannte Region erstreckt und als modB7-2 Gen (modulator of B7-2) bezeichnet wurde. Die durch die RNA-Analysen gewonnenen Erkenntnisse stehen im Einklang mit den durch die Analyse von MCMV-Mutanten gewonnenen Erkenntnissen, da alle MCMV-Mutanten, in denen der identifizierte ORF getroffen wurde einen Loss-of-Function Phänotyp zeigten. Die RNA-Analysen gaben keinen Hinweis auf die Expression der anderen in diesem Bereich lokalisierten ORFs, jedoch wurde die Untersuchung nur zu dem genannten Zeitpunkt und mit den genannten Zellen durchgeführt. Folglich kann nur geschlossen werden, dass die ORFs m147, m148 und m149 24 h nach Infektion von RAW-Zellen nicht exprimiert werden.

Dem Nachweis der Existenz von einem gespleißten Gen folgte der Nachweis, dass dieses Gen für die Reduktion von CD86 auf APC verantwortlich ist. Besondere Aufmerksamkeit wurde der Frage der Unterscheidung der ORFs m147, m148 und modB7-2 gewidmet, die auf komplementären Strängen in der gleichen Region kodiert werden. Eine Insertionsmutante, bei der lediglich die cDNA von modB7-2 unter Kontrolle des MIEP-Promotors in das Genom einer Loss-of-Function-Mutante eingebracht worden war, zeigte einen Gain-of-Function Phänotyp. Da in dieser Mutante der 5´-Bereich des ORF m147 fehlte und somit keine Expression desselben stattfinden sollte, konnte der ORF m147 an dieser Stelle erneut ausgeschlossen werden. Die mit der Shuttle-Mutagenese hergestellte Mutante, in der der ORF modB7-2 selektiv gestört wurde zeigte einen Loss-of-Function-Phänotyp. Da der ORF m148 in dieser Mutante nicht beeinträchtigt wurde, wurde hiermit gezeigt, dass das Gen modB7-2 eine essentielle Komponente bei der Reduktion von CD86 ist. Da keine Mutante existiert, in der lediglich der ORF m148 gestört, der ORF modB7-2 jedoch intakt ist, kann keine Aussage dazu getroffen werden, ob m148 an der Ausführung der Funktion von

modB7-2 beteiligt ist. Der mangelnde Nachweis eines Transkripts von m148 lässt hierzu keine eindeutige Aussage zu, da keine lückenlose Analyse zu unterschiedlichen Infektionszeitpunkten durchgeführt wurde. Da alle untersuchten Virusmutanten, in denen der ORF von modB7-2 betroffen ist, einen vollständigen Ausfall des Phänotyps zeigten, kann jedoch davon ausgegangen werden, dass modB7-2 für diesen Effekt essentiell ist. Dies lässt jedoch keine Aussage zu der Frage zu, ob das Gen diesen Effekt allein hervorruft oder ob hierfür die Kooperation mit einem weiteren viralen Gen notwendig ist. Diese Frage wird durch die isolierte Expression des modB7-2-Gens unabhängig vom Virusgenom geklärt werden, die aufgrund technischer Schwierigkeiten bis dato nicht geglückt ist. Derzeit kann lediglich ausgeschlossen werden, dass eines der Gene aus der Region ∆6 für die Reduktion von CD86 durch modB7-2 notwendig ist, da das modB7-2-Protein diesen Effekt auch in Abwesenheit der Gene der Region ∆6 induziert.

Die Markierung des ModB7-2-Proteins mit einem Epitoptag ermöglichte die Untersuchung der Kinetik der Proteinexpression sowie die für die Transkription von modB7-2 notwendigen Faktoren. Die Klassifizierung von modB7-2 als frühes Gen bedeutet, dass für die Expression virale Transkriptionsfaktoren notwendig sind. In diese Proteinklasse gehören viele immunmodulatorische Gene, wie zum Beispiel die Gene US2 und US11 von HCMV, welche mit der Expression von MHC I auf infizierten Zellen interferieren (Jones et al., 1995). Eine Ausnahme bildet das HCMV-Protein US3, welche ebenfalls diese Aufgabe erfüllt, aber ein immediate-early Gen ist (Colberg-Poley et al., 1992; Tenney et al., 1993; Tenney and Colberg-Poley, 1991).