Einfluss einer MCMV-Infektion auf den sekretorischen Apparat und die

Eine weitere Möglichkeit, wie der beobachtete Phänotyp hervorgerufen werden könnte, ist die Blockierung von Proteintransport durch das Endoplasmatische Retikulum (ER) und/oder den Golgi-Apparat. Eine solche Blockierung kann unter anderem durch eine Umstrukturierung der Kompartimente erreicht werden. Um zu untersuchen, ob die Infektion mit MCMV einen Einfluss auf die Struktur des endoplasmatischen Retikulums und den Golgi-Apparat von Antigen-präsentierenden Zellen hat, wurden DC2.4-Zellen mit wtMCMV-GFP infiziert und mit Antikörpern gegen ein Protein des ER-cis-Golgi Kompartiments, den KDEL-Rezeptor, gefärbt. Die Verwendung des wtMCMV-GFP-Virus erlaubte die Unterscheidung von infizierten (GFP-positiven) und nicht-infizierten (GFP-negativen) Zellen.

Abb 42: Einfluss der MCMV-Infektion auf den ER/Cis-Golgi Apparat

DC2.4-Zellen wurden mit Antikörpern gegen den KDEL-Rezeptor gefärbt. In der linken Abbildung wurden der rote und der grüne Kanal dargestellt und in der rechten Abbildung nur der rote Kanal.

In beiden Bildern der Abb. 42 sind links eine nicht-infizierte und rechts eine MCMV-infizierte Zelle dargestellt. Die Verteilung des KDEL-Rezeptors ist in rot gezeigt. Ein Vergleich der Verteilung des KDEL-Rezeptos in infizierten und nicht-infizierten Zellen

rot: KDEL-Rezeptor

grün: GFP rot: KDEL-Rezeptor

rot: KDEL-Rezeptor

grün: GFP rot: KDEL-Rezeptor

zeigt, dass keine wesentlichen Unterschiede zwischen diesen beiden Zellen bestehen und folglich das ER bzw der Cis-Golgi-Apparat auch in infizierten Zellen strukturell intakt sind.

Nachdem zunächst der Einfluss einer MCMV-Infektion auf den sekretorischen Apparat von APC betrachtet wurde, wurden in den nächsten Versuchen die intrazelluläre Lokalisierung der beiden zellulären Proteine CD40 und CD86 und der Einfluss einer MCMV-Infektion hierauf genauer analysiert. Die bisherigen Ergebnisse basieren auf FACS-Analysen, die lediglich die Quantifizierung von Protein auf der Oberfläche von Zellen ermöglicht und Infolgedessen sie keine Aussage über innnerhalb der Zelle vorhandene Proteine erlaubt. Mit Hilfe der Färbung von CD40 und CD86 in permeabilisierten MCMV-infizierten Zellen sollte nun festgestellt werden, ob die Infektion einen Einfluss auf die intrazellulär vorhandene Proteinmenge hat. Da dies keine quantitative Methode ist, begrenzt sich diese Aussage auf eine An-oder Abwesenheit von Protein. Weiterhin wurde die Lokalisierung der zellulären Proteine betrachtet, um eventuell vorhandene Unterschiede zwischen infizierten und nicht-infizierten Zellen festzustellen. Da es Hinweise auf ein für APC spezifisches Kompartiment gibt, in dem CD86 und MHC II gemeinsam aufbewahrt bzw. transportiert werden, wurde MHC II in diese Untersuchungen mit einbezogen (Geuze, 1998;

Kleijmeer et al., 1997; Peters et al., 1995). Hierfür wurden DC2.4-Zellen mit wtMCMV-GFP infiziert, zu einem Zeitpunkt an dem die Reduktion der Zelloberflächenproteine seinen Maximalwert erreicht hat fixiert, permeabilisiert und mit Antikörpern gegen CD40, CD86 und MHC II gefärbt.

In Abb. 43 sind eine nicht-infizierte und eine mit wtMCMV-GFP infizierte Zelle (mit Pfeil gekennzeichnet) dargestellt, die mit Antikörpern gegen CD40 (obere Abbildungen), CD86 (mittlere Abbildungen) und MHC II (untere Abbildungen) gefärbte wurden. Bei den nicht-infizierten Zellen zeigten die Proteine eine vesikuläre Verteilung, die sich über die ganze Zelle erstreckte. Besonders im Fall von CD86 gab es eine Konzentrierung in der Nähe des Zellkerns. In allen drei Fällen konnte auch in den infizierten Zellen noch Protein detektiert werden. Ferner wurde deutlich, dass die infizierten und nicht-infizierten Zellen auch bezüglich der Lokalisierung der Proteine CD40, CD86 und MHC II vergleichbar waren. Folglich konnte für keines der untersuchten zellulären Proteine eine Umlokalisierung oder eine detektierbare Reduzierung der Menge nachgewiesen

Abb. 43: Intrazelluläre Lokalisierung von CD40, CD86 und MHC II in wtMCMV-GFP-infizierten und nicht-wtMCMV-GFP-infizierten DC2.4-Zellen

DC2.4-Zellen wurden mit wtMCMV-GFP und 24 Stunden p. i. mit Antikörpern gegen CD40 (oben), CD86 (Mitte) und MHC II (unten) gefärbt. In den linken Abbildungen wurden der rote und der grüne Kanal dargestellt und in den rechten Abbildungen nur der rote Kanal

Rot: CD40 Grün: GFP

Rot: CD40

Rot: CD86 Grün: GFP

Rot: CD86

Rot: MHC II

Grün: GFP Rot: MHC II

Rot: CD40 Grün: GFP Rot: CD40 Grün: GFP

Rot: CD40 Rot: CD40

Rot: CD86 Grün: GFP Rot: CD86 Grün: GFP

Rot: CD86 Rot: CD86

Rot: MHC II Grün: GFP Rot: MHC II

Grün: GFP Rot: MHC IIRot: MHC II

Im nächsten Experiment wurde der Recyclingweg von CD40 und CD86 sowie deren in nicht-infizierten DC2.4-Zellen untersucht. Einige der auf der Zelloberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen exprimierten Proteine stehen in einem ständigen Kreislauf der Internalisierung und erneutem Transport an die Zelloberfläche, dies trifft besonders auf Rezeptoren zu, die mit ihrem Liganden endozytiert und dann recycelt werden (Herbst et al, 1994). Ein ebenfalls einem solchen Kreislauf unterliegendes Protein ist der Transferrin-Rezeptor, der das eisenbeladene Transferrin-Protein bindet, über den clathrinabhängigen Weg der rezeptorvermittelten Endozytose internalisiert und in ein early sorting Endosome transportiert wird (Fan, Carpentier, 1982). Im early sorting Endosome wird das Eisen entlassen und der Transferrin/Transferrin-Rezeptorkomplex akkumuliert sich in einem Recyclingkompartiment, von wo er wieder an die Zelloberfläche transportiert wird. Folglich ist der Transferrin-Rezeptor auf der Zelloberfläche oder in zelloberflächennahen Vesikeln (early sorting Endosome und Recyclingkompartiment) nachweisbar. In dem vorliegenden Experiment wurde untersucht, ob die Proteine CD40 und CD86 eine Kolokalisierung mit dem Transferrin-Rezeptor aufweisen. Dies würde darauf hindeuten, dass CD40 und CD86 durch die early sorting Endosome und/oder das Recyclingkompartiment transportiert werden und die rezeptorvermittelte Endozytose bei deren Internalisierung eventuell eine Rolle spielt.

Abb. 44: Lokalisierung des Transferrin-Rezeptors und CD40 bzw. CD86 in dendritischen Zellen

DC2.4-Zellen wurden mit Antikörpern gegen CD 40 (links, rot) und CD86 (rechts, rot) sowie den Transferrin-Rezeptor (grün) gefärbt.

Rot: CD40

Grün: Transferrin-Rezeptor

Rot: CD86

Grün: Transferrin-Rezeptor

Rot: CD40

Grün: Transferrin-Rezeptor

Rot: CD86

Grün: Transferrin-Rezeptor

Wie auf Abb. 45 ersichtlich, ist die Hauptmenge von CD40 und CD86 in vesikulären Strukturen im Inneren der Zelle zu sehen. Es konnte keine ausgeprägte Kolokalisierung zwischen CD40 und CD86 und dem Transferrin-Rezeptor nachgewiesen werden. Es ist folglich anzunehmen, dass weder CD40 noch CD86 den gleichen Weg der rezeptorvermittelten Endozytose und den Transport in Recyclingkompartimente nehmen, wie der Transferrin-Rezeptor. Die vorliegenden Untersuchungen sind hierfür jedoch nur ein erster Hinweis, da die Sensitivität von Antikörperfärbungen nur den Nachweis von einer bestimmten Proteinmenge zulässt. Falls die Proteine CD40 und CD86 jedoch nur eine kurze Verweildauer in den genannten Kompartimenten haben bzw. nur eine gerine Proteinmenge internalisiert wird, ist ein Nachweis der Kolokalisierung von CD40 und CD86 mit dem Transferrin-Rezeptor mit der hier genutzten Methode nicht möglich.