HOPE ® -fixiertes Material

Bei den Reihenuntersuchungen an HOPE^®-fixiertem Material konnte abgesehen von einer Ausnahme bei allen Proben, die in den Gefrierschnittkontrollen eine positive Reaktion zeig-ten, auch eine immunhistologische Darstellung von CD8⁺ T-Lymphozyten erzielt werden.

Lediglich in Milzgewebe von Tgb.-Nr. S179/10, das aufgrund fortgeschrittener postmortaler Veränderungen überwiegend einen hochgradigen Verlust der morphologischen Strukturen aufwies, gelang in HOPE^®-fixiertem Material kein Nachweis von CD8⁺ T-Lymphozyten.

Hierbei ist anzumerken, dass auch die zugehörige Gefrierschnittkontrolle infolge fortgeschrit-tener postmortaler Veränderungen überwiegend einen hochgradigen morphologischen Struk-turverlust aufwies und nur in den verbliebenen kleinen Arealen mit erhaltener Gewebestruktur einzelne wenige CD8⁺ T-Lymphozyten nachgewiesen werden konnten (siehe unter 4.1.2.1).

In HOPE^®-fixiertem Milzgewebe von Tgb.-Nr. S180/10 war ebenfalls keine immunhistologi-sche Markierung von CD8⁺ T-Lymphozyten zu beobachten. Jedoch war in diesem Fall auch die Gefrierschnittkontrolle negativ, die gleichfalls über die gesamte Probe hinweg einen voll-ständigen Verlust der morphologischen Strukturen infolge fortgeschrittener postmortaler Ver-änderungen aufwies (siehe unter 4.1.2.1).

Die Färbeintensität der immunhistologischen Reaktion lag in dem HOPE^®-fixierten Material durchgehend unter der des als Standard dienenden Gefriermaterials. Mit Ausnahme des Milz-gewebes von Tgb.-Nr. S179/10 wiesen alle HOPE^®-fixierten Proben eine geringfügig (mit

„++“ bewertete Proben, siehe Abb. 11) oder deutlich (mit „+“ bewertete Proben, siehe Abb. 12) niedrigere Färbeintensität als die zugehörigen Gefrierschnittkontrollen auf. In keiner der HOPE^®-fixierten Proben war eine identische oder höhere Färbeintensität als in der Ge-frierschnittkontrolle zu beobachten.

Eine detaillierte Zusammenstellung der Ergebnisse ist in Tabelle 8.1.6 im Anhang zu finden.

Ergebnisse

a b

Abbildung 11: a: Färbeintensität in dem HOPE^®-fixierten Material geringfügig niedriger als in der zugehörigen Gefrierschnittkontrolle (b). Tgb.-Nr. S176/06 (HOPE^®);

b: Gefrierschnittkontrolle. Tgb.-Nr. S176/06 (GF); a und b: LK, Obj. x 10, Maus anti-Katze CD8, PAP, Papanicolaous Hämatoxylin Gegenfärbung

a b

Abbildung 12: a: Färbeintensität in dem HOPE^®-fixierten Material deutlich niedriger als in der zugehörigen Gefrierschnittkontrolle (b). Tgb.-Nr. S176/06 (HOPE^®);

b: Gefrierschnittkontrolle. Tgb.-Nr. S176/06 (GF); a und b: Milz, Obj. x 20, Maus anti-Katze CD8, PAP, Papanicolaous Hämatoxylin Gegenfärbung

Ergebnisse

Solange der Strukturerhalt des Gewebes nicht durch schnittbedingte Artefakte (z. B. Rissbil-dung) und fortgeschrittene postmortale Veränderungen beeinträchtigt war, wiesen die als po-sitiv beurteilten HOPE^®-fixierten Proben durchgehend eine einheitliche Färbeintensität über den ganzen Schnitt hinweg auf (siehe Abb. 13). Aufgrund der durchgehend schwächeren In-tensiät des immunhistologischen Signals ließen sich einzeln (und nicht in Gruppen) liegende positive CD8⁺ T-Lymphozyten, z. B. im Markbereich des Mesenteriallymphknotens, deutlich schwieriger ausmachen als in den Gefrierschnittkontrollen.

Abbildung 13: Nachweis von CD8⁺ T-Lymphozyten in HOPE^®-fixiertem Material. Färbein-tensität über den ganzen Schnitt einheitlich stark. Tgb.-Nr. S193/10 (HOPE^®, FD 44 h), LK, Obj. x 2,5. Maus anti-Katze CD8, PAP, Papanicolaous Häma-toxylin Gegenfärbung

Im Hinblick auf den erforderlichen Erhaltungszustand des Ausgangsmaterials war festzustel-len, dass der Nachweis von CD8⁺ T-Lymphozyten an frischen und nicht mehr frischen Gewe-ben gelang, deren Lagerungsdauer von einer Stunde (Tgb.-Nr. S359/07) bis drei Tage (Tgb.-Nr. S111/10) reichte und die z. T. auch über den Postweg eingesendet worden waren.

Bei Tgb.-Nr. S180/10 und Tgb.-Nr. S179/10 erfolgte der Nachweis sogar an zuvor eingefro-renem Material.

Ergebnisse

Anhand der Tagebuchnummern S359/07, S176/06 und S1525/06 ließ sich nachweisen, dass die immunhistologische Darstellung von CD8⁺ T-Lymphozyten in HOPE^®-fixiertem Material auch nach einer Einlagerungsdauer der Paraffinblöcke von 4 bzw. 5 Jahren gelang.

Es sollte im Hinblick auf die Eignung der Fixierungsmethode für den Einsatz in einem Routi-nelabor zudem überprüft werden, ob die Fixierungsdauer einen Einfluss auf den Antigenerhalt von CD8 in HOPE^®-fixiertem Gewebe hat (siehe unter 3.3.3). Hierzu wurden die bei man-chen Tagebuchnummern gewonnenen Proben mit unterschiedlicher Fixierungsdauer bei den Reihenuntersuchungen mitinkubiert und ebenfalls im Hinblick auf die Färbeintensität mit den jeweiligen Kontrollgefrierschnitten verglichen. Die in Tabelle 8.1.6 im Anhang zusammenge-fassten Ergebnisse lassen gewisse Unterschiede hinsichtlich der Färbeintensität zwischen den Proben mit unterschiedlicher Fixierungsdauer erkennen. In den kürzer fixierten Proben einer Tagebuchnummer konnte im Vergleich zu den länger fixierten Proben derselben Tagebuch-nummer stets eine mindestens gleichstarke oder höhere Färbeintensität beobachtet werden. In keinem Fall wies die länger fixierte Probe eine höhere Färbeintensität auf. Grundsätzlich konnte hierbei aber festgestellt werden, dass trotz der beobachteten Schwankungen hinsicht-lich der Färbeintensität die Nachweisbarkeit des Antigens auch in den länger fixierten Proben stets erhalten blieb, wobei die untersuchte Zeitspanne die für Einsendungen relevante Fixie-rungsdauer von 40 h bis 67 h umfasste.

Um den Einfluss der Fixierungsdauer auf den Antigenerhalt genauer zu überprüfen, wurde wie unter 3.3.3 ausführlich beschrieben anhand der sehr frischen Tagebuchnummer S606/10 ein gesonderter Fixierungsversuch über eine wesentlich weitere Spanne von Fixierungszeiten durchgeführt (siehe unter 4.1.3.1).

Analog zum Gefriermaterial zeigte sich, dass die Lokalisierbarkeit des immunhistologischen Signals von dem Grad der postmortalen Veränderungen des Gewebes abhing. Bei dem Me-senteriallymphknotengewebe von Tgb.-Nr. S179/10 und Tgb.-Nr. S180/10, das in beiden Fäl-len Areale mit fortgeschrittenen postmortaFäl-len Veränderungen aufwies, fiel auf, dass das im-munhistologische Signal auch in HOPE^®-fixiertem Gewebe wesentlich weniger präzise loka-lisierbar war als dies bei den anderen HOPE^®-fixierten Proben der Fall war. Vorherrschend fand sich hier anders als unter 4.1.1.3 beschrieben eine granuläre Braunfärbung in der Peri-pherie der einzelnen Zellen, die diesen nicht präzise zuzuordnen war, sodass diese nicht als eindeutig positiv anzusprechen waren (siehe Abb. 14). Erschwerend kam noch eine deutlich

Ergebnisse

erhöhte Hintergrundfärbung hinzu. Beim Vergleich der beiden Mesenteriallymphknotenpro-ben von Tgb.-Nr. S179/10 fiel auf, dass dieses Phänomen in der Probe mit der er von 67 h deutlich stärker ausgeprägt war als bei der Probe mit der kürzeren Fixierungsdau- Fixierungsdau-er von 43 h, wodurch sich im direkten VFixierungsdau-ergleich auch eine schlechtFixierungsdau-ere Färbeintensität dFixierungsdau-er länger fixierten Probe ergab.

a b

Abbildung 14: HOPE^®-fixiertes Material. a: Frisches Gewebe. Präzise zu lokalisierende Markierung der CD8⁺ T-Lymphozyten. Tgb.-Nr. S161/10 (HOPE^®, FD 40 h); b: Gewebe mit fortgeschrittenen postmortalen Veränderungen.

Signal wesentlich unschärfer begrenzt und schlechter lokalisierbar. Höhere Hintergrundfärbung. Beurteilung eindeutig positiver Zellen deutlich er-schwert. Tgb.-Nr. S179/10 (HOPE^®, FD 43 h); a und b: LK, Obj. x 100.

Maus anti-Katze CD8, PAP, Papanicolaous Hämatoxylin Gegenfärbung

Ergebnisse