3.4 Immunhistologische Untersuchung
3.4.5 Auswertung
3.4.5.2 Beurteilungsverfahren
3.4.5.2.1 Ermittlung der optimalen Gebrauchsverdünnung des Primärantikörpers in Abhängigkeit von der jeweiligen Fixierungstechnik
Als optimale Gebrauchsverdünnung des Primärantikörpers wurde aus der hergestellten Ver-dünnungsreihe (siehe unter 3.4.2.2.1) für die unterschiedlich fixierten Gewebeproben von Tgb.-Nr. S161/10 jeweils diejenige definiert, die bei maximalem Signal-Rausch-Verhältnis die höchstmögliche Verdünnung des Primärantikörpers erlaubte, ohne dass im Vergleich zur nächstniedrigeren Verdünnungsstufe ein Verlust der Färbeintensität (Intensität des braunen Farbniederschlags und Anzahl der eindeutig markierten Zellen) auftrat. Hierzu wurden die verschiedenen Verdünnungsstufen der jeweiligen Fixierungsmethode miteinander verglichen, entsprechend den Kriterien des in Tabelle 7 dargestellten Beurteilungsschemas in Bezug zu einander gesetzt und absteigend sortiert.
Tabelle 7: Kriterien zur Beurteilung der Färbeintensität bei Ermittlung der Gebrauchsver- dünnung
Symbol Bedeutung
= Kein Unterschied hinsichtlich der Intensität des Signals und der Anzahl der eindeutig markierten Zellen im Vergleich zur vorhergehenden Probe
(>)
Geringgradige Abnahme der Intensität des Signals, kein Unterschied hin-sichtlich der Anzahl der eindeutig markierten Zellen im Vergleich zur vorhergehenden Probe
> Geringgradige Abnahme der Intensität des Signals und der Anzahl der eindeutig markierten Zellen im Vergleich zur vorhergehenden Probe
>> Deutliche Abnahme Intensität des Signals und der Anzahl der eindeutig markierten Zellen im Vergleich zur vorhergehenden Probe
- Keine eindeutig markierten Zellen erkennbar
Material und Methoden
3.4.5.2.2 Vergleich von Formalin-, HOPE®- und ZSF-fixiertem Gewebe mit Gefrierma-terial hinsichtlich der immunhistologischen Darstellung von CD8
Die Färbeintensität des paraffineingebetteten Formalin-, HOPE®- und ZSF-fixierten Materials wurde jeweils mit der des parallel immunhistologisch inkubierten Gefriermaterials verglichen, wobei dieses als Standard diente und Milz sowie Mesenteriallymphknoten im Falle einer ein-deutigen Markierung von CD8+ T-Lymphozyten stets die Färbeintensität „+++“ zugewiesen wurde. Gefrierschnitte, in denen keine eindeutig markierten Zellen nachgewiesen werden konnten, wurden mit „-“ belegt. Mit „+++“ wurden Formalin-, HOPE®- und ZSF-fixierte Pro-ben bewertet, wenn sie eine dem zugehörigen Gefrierschnitt vergleichbare Färbeintensität aufwiesen. Mit „(+++)“ wurden die Schnitte beurteilt, die im Vergleich zum Gefriermaterial lediglich eine etwas geringere Intensität des Signals aber keine verminderte Anzahl eindeutig markierter Zellen aufwiesen. „++“ bedeutete einen geringgradigen Verlust der Intensität des Signals und eine geringgradige Abnahme der Zahl eindeutig markierter Zellen. Mit „+“ wur-den Schnitte belegt, die eine deutlich schwächere Intensität des Signals und eine deutliche geringere Anzahl eindeutig markierter Zellen zeigten. Wurden im gesamten Schnitt keine eindeutig markierten Zellen gefunden, so wurde dieser mit „-“ bewertet. Die Einteilungskrite-rien und die verwendeten Symbole sind in Tabelle 8 zusammengefasst.
Um eine angemessene Vergleichbarkeit zwischen Paraffin- und Gefriermaterial zu gewähr-leisten, wurden die als Standard dienenden Gefrierschnitte mit der gleichen Verdünnungsstufe des Primärantikörpers (1:50) inkubiert wie die Formalin-, HOPE® -und ZSF-fixiertem Gewe-be, auch wenn dies insbesondere im Milzgewebe zu einer hohen Hintergrundfärbung in den Gefrierschnitten führte (siehe unter 4.1.1.1). Allerdings wurde bei jeder Tagebuchnummer zusätzlich auch ein Gefrierschnitt mit der zuvor als optimal ermittelten Verdünnungsstufe 1:500 inkubiert (siehe unter 4.1.1.1), um zu überprüfen, ob an Gefriermaterial der Einsatz einer im Vergleich zum paraffineingebettetem Gewebe zehnfach höheren Verdünnung durch-gehend möglich gewesen wäre.
Material und Methoden
Tabelle 8: Beurteilung der Färbeintensität des Formalin-, HOPE® -und ZSF-fixierten Ge-webes im Vergleich zu dem jeweils parallel inkubierten Gefrierschnitt (Gefrier-schnittkontrolle)
Symbol Bedeutung
+++ Kein Unterschied hinsichtlich der Intensität des Signals und der Anzahl der eindeutig markierten Zellen im Vergleich zur Gefrierschnittkontrolle (+++) Geringgradige Abnahme der Intensität des Signals, kein Unterschied
hin-sichtlich der Anzahl der eindeutig markierten Zellen im Vergleich zur Gefrierschnittkontrolle
++ Geringgradige Abnahme der Intensität des Signals und der Anzahl der eindeutig markierten Zellen im Vergleich zur Gefrierschnittkontrolle + Deutliche Abnahme der Intensität des Signals und der Anzahl der
eindeu-tig markierten Zellen im Vergleich zur Gefrierschnittkontrolle - Keine eindeutig markierten Zellen erkennbar
3.4.5.2.3 Einfluss der Fixierungsdauer auf den Antigenerhalt in HOPE®- und ZSF-fixiertem Material
Um den Einfluss der Fixierungsdauer auf den Antigenerhalt zu untersuchen, wurden die un-terschiedlich lange im jeweiligen Fixans belassenen HOPE®- und ZSF-fixierten Proben der Tgb.-Nr. S606/10 (siehe Tabelle 8.1.2 im Anhang) parallel immunhistologisch gefärbt, an-schließend jeweils hinsichtlich der Färbeintensität miteinander verglichen und absteigend sor-tiert. Dies erfolgte nach dem in Tabelle 7 unter 3.4.5.2.1 dargestellten Beurteilungsschema.
Zusätzlich wurden die Proben hinsichtlich der Färbeintensität mit der zugehörigen Gefrier-schnittkontrolle verglichen und gemäß den in Tabelle 8 unter 3.4.5.2.2 genannten Kriterien beurteilt. Um einen eventuell vorhandenen Unterschied im Antigenerhalt anhand der Färbein-tensität stärker hervortreten zu lassen, wurde bei diesem Versuchsansatz, anders als unter 3.4.2.2.1 beschrieben, nicht die für HOPE®- und ZSF-Material als optimal ermittelte Gebrauchsverdünnung des Primärantikörpers von 1:50 eingesetzt, sondern die nächsthöhere Verdünnungsstufe 1:100.
Material und Methoden
3.4.5.2.4 Einfluss der Modifizierung des Prozessierungsprotokolls auf den Antigener-halt bei der ZSF-Fixierung
3.4.5.2.4.1 Vergleich von nach modifiziertem Protokoll im Gewebeeinbettungsautoma-ten prozessiertem, ZSF-fixiertem Material mit manuell nach dem Protokoll von Beckstead (1994) prozessiertem ZSF-M Material
Es sollte beurteilt werden, ob sich die aus den unter 3.3.4.2 genannten Gründen durchgeführte Modifizierung des von Beckstead (1994) vorgegebenen Prozessierungsprotokolls bei der ZSF-Fixierung auf den immunhistologischen Nachweis von CD8 auswirkt. Hierzu wurden die nach dem Routineprotokoll im Gewebeeinbettungsautomaten prozessierten ZSF-fixierten Proben (Tgb.-Nr. S359/07 (ZSF)) mit den manuell nach den Vorgaben von Beckstead (1994) prozessierten ZSF-M Proben (Tgb.-Nr. S359/07 (ZSF-M, PD 30 min)) nach paralleler im-munhistologischer Inkubation jeweils hinsichtlich des Färbeergebnisses miteinander vergli-chen. Aus den unter 3.4.5.2.3 genannten Gründen wurde bei diesem Versuchsansatz der Pri-märantikörper in der Verdünnung 1:100 verwendet.
3.4.5.2.4.2 Vergleich von manuell nach dem Protokoll von Beckstead (1994) prozessier-tem ZSF-M Material unterschiedlicher Paraffinierungsdauer
Um zu überprüfen, ob eine verlängerte Paraffinierungsdauer einen Einfluss auf den immun-histologischen Nachweis von CD8+ T-Lymphozyten in manuell nach dem Protokoll von Beckstead (1994) prozessiertem ZSF-M Material hat, wurden die unterschiedlich lange in Paraffin inkubierten ZSF-M Proben von Tgb.-Nr. S359/07 (siehe unter 3.3.4.2.3 sowie Tabel-le 8.1.2 im Anhang) in einem Inkubationsansatz immunhistologisch gefärbt. Anschließend wurden sie bezüglich ihrer Färbeintensität miteinander verglichen und entprechend den in Tabelle 7 unter 3.4.5.2.1 genannten Kriterien beurteilt. Aus den unter 3.4.5.2.3 erläuterten Gründen wurde bei diesem Versuchsansatz der Primärantikörper in der Verdünnung 1:100 eingesetzt.
3.4.5.2.5 Einfluss der Entparaffinierung und Rehydrierung auf den Antigenerhalt in HOPE®-fixiertem Material
Es sollte überprüft werden, ob sich bei HOPE®-fixiertem Material eine herkömmliche Entpa-raffinierung und Rehydrierung mit Xylolersatz und Ethanol wie in den Herstellerangaben be-schrieben nachteilig auf den Antigenerhalt auswirken würde (siehe unter 3.4.3.3). Hierzu
Material und Methoden
Färbeintensität miteinander verglichen und gemäß dem in Tabelle 7 unter 3.4.5.2.1 aufgeführ-ten Beurteilungsschema bewertet. Der Primärantikörper wurde bei diesem Inkubationsansatz aus den unter 3.4.5.2.3 dargelegten Gründen in der Verdünnung 1:100 verwendet.
Ergebnisse