Die Homodimerisierung von PRO11 und die besondere Rolle des N-Terminus

Als weiteres Ergebnis brachte die Two-Hybrid Analyse hervor, dass PRO11 ein Homodimer bildet. Es ist anzunehmen, dass die Homodimerisierung über das „coiled-coil“-Motiv erfolgt, da das in der Analyse eingesetzte Konstrukt für die ersten 110 AS des PRO11-Proteins kodiert und die daraus resultierende Protein-Version nur die Caveolin-Bindedomäne, das „coiled-coil“-Motiv und die putative Calmodulin-Bindedomäne enthält. Eine Homo- und Hetero-Oligomerisierung

über das „coiled-coil“-Motiv wurde außerdem bereits für alle Proteine der Striatin-Familie aus Säugern beschrieben (Gaillard et al. 2006). Eine Funktion des PRO11-Homodimers könnte sein, dass die Bildung eines „Doppel“-Gerüstproteins eine noch größere und komplexere Formation von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken erlaubt.

Darüber hinaus gibt es mehrere Hinweise, dass das „coiled-coil“-Motiv im N-terminalen Teil von Striatin-Proteinen weitere wichtige Funktionen übernimmt. So ist beispielsweise in Säugern die Oligomerisierung der Proteine über die „coiled-coil“-Domäne die entscheidende Voraussetzung für die Lokalisierung in den neuronalen dendritischen Dornen (Gaillard et al. 2006). In dem pflanzenpathogenen Pilz F. verticillioides vermittelt das „coiled-coil“-Motiv die Virulenz zur Induzierung der Mais-Stielfäule (Yamamura und Shim 2008).

Neben dem „coiled-coil“-Motiv übernehmen auch die weiteren N-terminalen Domänen von Striatin-Proteinen wichtige Funktionen.

So dient in Säugern die Bindung von Caveolin über die Caveolin-Bindedomäne vermutlich der Assoziierung der Striatin-Komplexe an spezialisierte Mikrodomänen der Plasmamebran (Caveolae). An den Caveolae werden Signalmoleküle spezifisch zusammengeführt und sie bilden somit den Ursprung verschiedener zellulärer Prozesse wie z. B. der Endocytose oder der Signaltransduktion (Brazer et al. 2003, Murata et al. 2007, Pani und Singh 2009, Pike 2006).

Gaillard et al. (2001) zeigten, dass alle Proteine der Striatin-Familie über die Caveolin-Bindedomäne an das Caveolin-1 Protein binden. Ein Sequenzvergleich von Striatin-Proteinen ergab, dass auch in PRO11 aus S. macrospora eine putative Caveolin-Bindedomäne enthalten ist (III Ergebnisse, Abb 14). Die pilzliche Caveolin-Bindedomäne ist vom gleichen Typ wie die der Säuger-Proteine (ΦxΦxxxxΦxxΦ) und ist darüber hinaus mit 64 % Sequenzähnlichkeit stark konserviert. Dieses Ergebnis ist erstaunlich, da das Genom von S. macrospora für kein homologes Caveolin-1 Protein kodiert (Nowrousian et al. 2010). Um ein Protein zu identifizieren, welches möglicherweise mit der Caveolin-Bindedomäne von Pilzen interagieren könnte, wurde ein BLAST-Vergleich der Caveolin-1 Gerüstdomäne mit der N. crassa Datenbank durchgeführt.

Interessanterweise zeigten mehrere Proteine (NCU02706, NCU08917, NCU05425, NCU11773) eine hohe Identität (42-58 %) mit der Gerüstdomäne. Die aufgeführten Proteine beinhalten ein Protein unbekannter Funktion, ein integrales Membranprotein von Transportvesikeln (v-SNARE) und zwei mitochondrial assoziierte Proteine (McNew et al. 1998, Repetto und Tzagoloff 1989, Krause-Buchholz et al. 2006). Es kann daher in Betracht gezogen werden, dass im pilzlichen Organismus mehrere Proteine an den Membranen unterschiedlicher zellulärer Kompartimente eine Caveolin-ähnliche Funktion übernehmen. Dafür spricht auch, dass Einstülpungen der

Plasmamebran, welche die charakteristische Caveolae-Struktur bewirken, bislang in Pilzen nicht beobachtet werden konnten.

Eine weitere N-terminale Domäne des PRO11-Proteins bildet die putative Calmodulin-Bindedomäne. Es wird angenommen, dass Striatin-Proteine durch die Ca²⁺-abhängige Bindung von CaM in Signaltransduktionsprozesse involviert sind (Benoist et al. 2006).

Für das Säuger-Striatin wurden ursprünglich zwei Calmodulin-Bindedomänen vorhergesagt: Nr. 1 an AS-Positionen 88-105 und Nr. 2 an den Positionen 149-166. Bartoli et al. (1998) wiesen durch Mutagenese-Experimente nach, das Nr. 2 die funktionell wichtige Domäne für die CaM-Bindung darstellt. Die in PRO11 vorhergesagte Calmodulin-Bindedomäne korreliert bezüglich der Position in der Proteinsequenz mit der nicht funktionellen Domäne Nr. 1 des Säuger-Striatins. Es ist daher nicht auszuschließen, dass der korrespondierende PRO11-Sequenzbereich keine funktionelle Calmodulin-Bindedomäne repräsentiert. Eine Beteiligung von PRO11-Komplexen in Ca²⁺/Calmodulin-abhängigen Signalwegen könnte dennoch indirekt möglich sein. Einer der in dem S. macrospora Two-Hybrid „Screen“ identifizierten Interaktionspartner des PRO11 N-Terminus ist die Phosphoglucomutase (NCU10058; Pgm2p), welche wiederum mit CaM interagiert. Die Phosphoglucomutase katalysiert im Hexose-Metabolismus die Konversion von Glukose-1- zu Glukose-6-Phosphat (Boles et al. 1994). Interessanterweise ist die zelluläre Ca²⁺ -Homöostase direkt von den relativen Mengen an Glukose-1- und Glukose-6-Phosphat abhängig (Aiello et al. 2002). PRO11 könnte daher über die Interaktion mit der Phosphoglucomutase die intrazelluläre Ca²⁺-Konzentration modulieren und gleichzeitig Ca²⁺/CaM-abhängige Signalwege induzieren. Es bedarf weiterführender Studien, um die Funktionalität der PRO11 Calmodulin-Bindedomäne zu klären. Eine Möglichkeit hierzu wäre, die direkte Interaktion von PRO11 und CaM in einer Two-Hybrid Analyse zu überprüfen. Alternativ könnte eine CaM-Sepharose Immunopräzipitation durchgeführt werden, bei der die Bindung von PRO11 an CaM über eine Antikörper-Reaktion und -Detektion nachgewiesen wird (Moreno et al. 2000).

Zwei weitere interessante Strukturmerkmale im N-terminalen Teil des PRO11-Proteins sind die teilweise konservierten SH3-Bindedomänen („Src Homology 3“) und die Akkumulation putativ phosphorylierter Serin-Reste. Die SH3-Bindedomäne ist ein Prolin-reiches Motiv, welches die Bindung an Proteine mit einer SH3-Domäne vermittelt (Mayer 2001). Eukaryotische Genome kodieren vielfältige SH3-Domänen Proteine (z. B. 20-30 in hemiascomycetischen Hefen und bis zu 300 im Mensch), welche an verschiedenen zellulären Prozessen, wie z. B. Signaltransduktion, Zell-Polarität, Zellteilung, Membran-Zytoskelett-Interaktionen, Hyphenwachstum und Vakuolen-Morphologie, beteiligt sind (Musacchio et al. 1992, Reijnst et al. 2010, Karkkainen et al. 2006). In den Hefe Two-Hybrid „Screens“ wurde kein SH3-Domänen Protein als Interaktionspartner

identifiziert, da die eingesetzen Köderproteine auf Grund der starken Transaktivierungsaktivität des PRO11 N-Terminus den Bereich der SH3-Bindedomänen nicht inkludierten. In vielen eukaryotischen Transkriptionsaktivatoren korrelieren saure Proteinbereiche mit einer Transaktivierungsaktivität und auch der Sequenzbereich 110-407 des PRO11 N-Terminus ist durch einen hohen Anteil der sauren AS Glutaminsäure und Asparaginsäure geprägt (Ptashne 1988). Im N-Terminus des Säuger-Homologs SG2NA wurde ebenfalls ein saurer Proteinabschnitt identifiziert, welcher eine starke Transaktivierungsaktivität bewirkte (Zhu et al. 2001). Die Identifikation eines möglichen SH3-Domänen Interaktionspartners von PRO11 könnte in zukünftigen Studien durch die Anwendung der TAP-Tag Methode („Tandem Affinity Purification“) erfolgen, eine in vivo Methode, die für pilzliche Organismen gut etabliert ist (Bayram et al. 2008, Busch et al. 2007).

Es ist wahrscheinlich, dass PRO11 mit Serin/Threonin-Kinasen und -Phosphatasen interagiert, da mehrere Serin-Phosphorylierungsstellen für das PRO11-Protein vorhergesagt wurden, die zum Teil auch in anderen pilzlichen Organismen konserviert sind. Interessanterweise konnte für das Säuger-Striatin bereits eine Wechselwirkung mit verschiedenen Kinasen und der Phosphatase PP2A in dem STRIPAK-Komplex nachgewiesen werden. Welche Kinasen und Phosphatasen mit PRO11 interagieren bildet einen Schwerpunkt weiterer Forschungen.

Ein eindrucksvoller Beleg dafür, dass auch der alleinige N-terminale Teil von Striatin-Proteinen in der Zelle für die Ausführung spezifischer Funktionen notwendig ist, ergibt sich aus der Existenz multipler Spleißvarianten, welchen das „WD-repeat“-Motiv teilweise oder gänzlich fehlt (Sanghamitra et al. 2008). Die kürzeste Variante umfasst nur die Caveolin-Bindedomäne, das

„coiled-coil“-Motiv, die Calmodulin-Bindedomäne und eine zusätzliche 19 AS lange Sequenz (Sanghamitra et al. 2008). In S. macrospora konnte das PRO11-Homolog dieser SG2NA-Variante identifiziert werden. Es wurde gezeigt, dass die alternativ gespleißte PRO11-Version keinen Einfluss auf die sexuelle Entwicklung ausübt, da eine ausschließliche Expression des PRO11 Voll-Längen Proteins nicht zu einer Beeinträchtigung in der Fruchtkörperentwicklung führte. Es bedarf daher zukünftiger Studien, um die Funktion des alternativen PRO11-Proteins näher einzugrenzen. Aufschluss könnte hier beispielsweise die Auswirkung einer Überexpression oder die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Lokalisierung eines GFP- oder DsRed-Fusionsproteins bringen.

2 Der PRO11/SmMOB3-Komplex reguliert in S. macrospora die sexuelle Differenzierung und die Hyphenfusion

2.1 Die Gene pro11 und Smmob3 werden während der sexuellen Entwicklung exprimiert