Herstellung von rekombinantem CTGF

Die CTGF-überexprimierende Zelllinie (HEK293-pCTGF) war bereits zu Beginn dieser Arbeit etabliert und die Produktion sowie die Sekretion von CTGF in den Zellüberstand nachgewiesen. Das rekombinante CTGF wurde über eine dreistufige Chromatographie aus dem Zellüberstand der HEK293-pCTGF-Zellen aufgereinigt.

Diese wurden in TripleFlasks und im FibraStage-Kultursystem kultiviert. In einem ersten Schritt wurden bis zu 2 l des zentrifugierten und filtrierten Mediums auf eine Heparinsäule geladen. Bei dieser Säule wurde die Affinität der C-terminalen Domäne des CTGF zu Heparin bzw. Heparinsulfatproteoglykanen ausgenutzt (Ball et al.

2003). Nicht-affine Proteine und Mediumbestandteile wurden anschließend durch Spülen mit Waschpuffer entfernt. Da nicht-kovalente Proteinbindungen empfindlich auf eine Veränderung des pH-Werts sowie der Salzkonzentration reagieren, konnte durch eine Erhöhung der NaCl-Konzentration auf 2 M die Bindung zwischen CTGF

1 Veröffentlicht in Junglas, B., A. H. Yu, U. Welge-Lussen, E. R. Tamm and R. Fuchshofer (2009).

"Connective tissue growth factor induces extracellular matrix deposition in human trabecular meshwork cells." Exp Eye Res 88(6): 1065-75.

Abb. 8: Induktion der CTGF-Expression in TWZ durch Behandlung mit IGF-1 für 6 und 24 h. A) qPCR; Es werden die Mittelwerte mit Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten gezeigt. */** markieren statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen und der Kontrolle (*p < 0,05; **p < 0,02).

B) CTGF-Western Blots.

und Heparin aufgehoben werden. Das Eluat wurde im Waschpuffer verdünnt, um wiederum eine physiologische Salzkonzentration herzustellen und erneut auf die Säule geladen. Diesmal erfolgte die Elution des gebundenen CTGF über einen Gradienten von 0,3 bis 2 M NaCl (Abb. 9A), wobei die Analyse der Eluate mittels SDS-Polyacrylamidgel und anschließender Silberfärbung bzw. Western Blot für das gewünschte Protein einen Elutionsbereich von ca. 0,7 bis 0,9 M NaCl ergab. Da noch weitere, unerwünschte Banden außer der für CTGF typischen Doppelbande bei 38 und 40 kDa (Yang et al. 1998; Wahab et al. 2001) auf dem Silbergel zu sehen waren, wurde ein weiterer Aufreinigungsschritt durchgeführt. Nachdem anzunehmen war, dass die verbliebenen Verunreinigungen ebenfalls eine Affinität zu Heparin aufwiesen, wurden im nächsten Schritt die Eigenschaften des dem CTGF angefügten Polyhistidin-Tags genutzt.

Die CTGF-enthaltenden Eluate wurden in Nickel-NTA Waschpuffer verdünnt und auf eine Nickel-NTA-Säule geladen. Die Histidinreste aus dem Polyhistidin-Tag waren in der Lage mit den Nickelionen der Säule einen nicht-kovalenten Komplex zu bilden, wodurch das CTGF an der Säule verblieb, während die restlichen Verunreinigungen durch Spülen mit Waschpuffer entfernt wurden. Die Elution erfolgte hier mit einem Gradienten von 0 bis 250 mM Imidazol (Abb. 9B), welches eine dem Histidinrest ähnliche Struktur aufweist und dadurch das gebundene CTGF von der Nickel-NTA-Säule verdrängen konnte. Die Reinheit wurde wiederum mittels Silberfärbung (Abb. 9C) und Western Blot (Abb. 9D) bestimmt. In den Fraktionen 18-20, eluiert bei Imidazol-Konzentration oberhalb von 170 mM, war allein das CTGF-Protein ohne weitere Verunreinigungen zu detektieren. Diese Fraktionen wurden vereinigt und dialysiert. Die densitometrische Konzentrationsbestimmung ergab für das in TripleFlasks produzierte CTGF ca. 10 µg/ml, während bei der Produktion im FibraStage-Kultursystem Konzentrationen zwischen 60 und 120 µg/ml erreicht werden konnten. Die in dieser Arbeit beschriebenen Versuche wurden aus diesem Grunde mit letzteren Aufreinigungen durchgeführt.

Um den Einfluss des rekombinant hergestellten CTGF auf die Zellen des TW zu untersuchen, wurden in vitro Versuche an isolierten primären Trabekelwerkzellkulturen, sowie an immortalisierten TWZ (HTM5) durchgeführt.

Hierzu wurden die Zellen nach einer 24-stündigen serumfreien Inkubation mit rekombinantem CTGF in Konzentrationen von 2,5 bis 100 ng/ml behandelt. Nach Isolation von RNA, Proteinen, sowie des Zellüberstands erfolgte die Analyse relevanter Veränderungen mittels Immunhistochemie, Western Blot, Northern Blot und qPCR, sowie mit weiteren im folgenden beschriebenen Techniken. Die hier dargestellten Ergebnisse wurden, soweit nicht anders beschrieben, durch Untersuchungen an primären TWZ gewonnen, konnten aber allesamt für die immortalisierten HTM5-Zellen bestätigt werden.

Abb. 9: Rekombinantes CTGF wurde mittels einer dreistufigen FPLC aufgereinigt. A) Elutionsdiagramm Heparinsäule; B) Elutionsdiagramm Ni²⁺-NTA-Säule; C) Silbergel der Ni²⁺-NTA-Elutionsfraktionen 13-21;

D) Western Blot der Ni²⁺-NTA-Elutionsfraktionen 13-21 mit spezifischem Antikörper gegen CTGF (38 kDa).

4.2.2 Der Einfluss von CTGF auf die extrazelluläre Matrix humaner Trabekelwerkzellen

FN stellt in situ einen der Hauptbestandteile der EZM in der juxtakanalikulären Region des humanen TW dar (Rodrigues et al. 1980; Murphy et al. 1987; Babizhayev und Brodskaya 1989). Sowohl die Ergebnisse der qPCR, wie auch bestätigend die des Northern Blots, zeigten einen konzentrationsabhängigen Anstieg der FN mRNA-Expression in Reaktion auf eine 24-stündige CTGF-Behandlung. Eine hohe statistische Signifikanz des Anstiegs auf das 2,7 ± 1,04- bzw. 4,5 ± 1,33-fache zeigte sich nach Behandlungen mit 50 und 100 ng/ml CTGF (Abb. 10A, B). Bestätigt wurden diese Ergebnisse durch Western Blot-Untersuchungen. In den Zellextrakten konnte neben dem gerade in den Zellen synthetisierten FN zudem dasjenige nachgewiesen werden, welches von den Zellen in Richtung des Bodens der Kulturschale abgegeben wurde, bzw. welches noch durch Zell-Matrix-Kontakte in Verbindung mit den Zellen stand. Hier erreichte die Expressionssteigerung mit dem 2,5 ± 0,8-fachen ihr Maximum bei einer Behandlung mit 50 ng/ml (Abb. 10C). In parallelen Experimenten wurde zudem untersucht, wie viel FN von den Zellen in das Kulturmedium abgegeben wurde. Wie bei den Zellextrakten zeigte sich auch hier ein maximaler Anstieg auf das 2,2 ± 1,0-fache bei einer CTGF-Konzentration von 50 ng/ml (Abb. 10D).

Vergleichbare Daten konnten für die Kollagene des Typs I und III gewonnen werden.

Diese Strukturproteine sind hauptsächlich in den gestreiften Kollagenfasern der Bindegewebslamellen des korneoskleralen TW zu finden (Marshall et al. 1991).

In Western Blot Analysen konnte die für die Kollagenuntereinheit 1α1 typische Bande bei 135 kDa in Zellextrakten detektiert werden (Abb. 11A). Durch Behandlung mit CTGF kam es zu einer Steigerung der Expression auf das 3,5 ± 1,4-fache. Wie auch bei FN wurde dieses Maximum bei einer CTGF-Konzentration von 50 ng/ml erreicht, wohingegen die Bande der Col3α1-Untereinheit des Kollagens Typ III (140 kDa) die höchste Intensität 1,6 ± 0,4-fach bei einer Behandlung mit 5 ng/ml aufwies. Bei CTGF-Konzentrationen von 50 und 100 ng/ml konnte keine Steigerung der Expression detektiert werden (Abb. 11B).

Kollagene des Typs IV stellen eine bedeutende Komponente aller Basalmembranen des menschlichen Körpers dar. Im TW finden sich diese netzbildenden EZM-Proteine in der Basalmembran der Bindegewebslamellen und im

Abb. 10: Änderung der Fibronektinexpression nach Behandlung von TWZ mit CTGF für 24 h. A) qPCR. Es werden die Mittelwerte mit Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten gezeigt. */** markieren statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen und der Kontrolle (*p < 0,05; **p < 0,02).

B) Northern Blot; C) Western Blot mit RIPA-Zelllysat; D) Western Blot mit Zellüberstand.

filamentösen Material der juxtakanalikulären Region (Rodrigues et al. 1980; Murphy et al. 1987; Marshall et al. 1990). Kollagen Typ IV ist aus verschiedenen Untereinheiten aufgebaut, von denen Col4α1, sowie Col4α2 die bedeutendsten darstellen. In den hier durchgeführten Western Blot Experimenten konnte die für die Kollagenuntereinheit α2(IV) spezifische Bande bei einer molekularen Masse von 190 kDa detektiert werden (Abb. 11C). Die Behandlung mit CTGF verursachte einen konzentrations-abhängigen Anstieg der Bandenintensität auf das bis zu 6,3 ± 2,3-fache bei einer Konzentration von 100 ng/ml.

Abschließend konnte auch bei Kollagenen des Typs VI ein Anstieg der Expression nach CTGF-Behandlung aufgezeigt werden. Kollagen Typ VI stellt einen Hauptbestandteil der fibrillären EZM im juxtakanalikulären TW dar (Lütjen-Drecoll et al. 1989). Die Expression der Col6α2-Untereinheit mit einer Größe von 140 kDa konnte bereits durch Behandlung mit einer CTGF-Konzentration von 5 ng/ml signifikant gesteigert werden. Das Maximum mit einer 2,0 ± 0,6-fachen Steigerung wurde bei einer Konzentration von 50 ng/ml erreicht, während eine Behandlung mit 100 ng/ml bereits wieder zu einem Abfall der Expression führte (Abb. 11D).

Abb. 11: Änderungen der Kollagenexpression nach Behandlung von TWZ mit CTGF für 24 h; Western Blots mit Zelllysat. A)Kollagen 1α1; B) Kollagen 3α1; C) Kollagen 4α2; D) Kollagen 6α2.