3.5.1 Tierhaltung
Die in dieser Arbeit verwendeten Tiere wurden in Einklang mit dem „ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research“ behandelt. Sie wurden alle in demselben Raum unter standardisierten Bedingungen (Temperatur 23 ± 2 °C, relative Luftfeuchtigkeit 55 ± 5 %, Futter und Wasser ad libitum) bei einem zwölfstündigen Hell-Dunkel-Rhythmus gehalten. Zur Zucht wurden jeweils transgene Mäuse, die spezifisch CTGF mit Hilfe des βB1-Crystallin-Promotors in der Linse überexprimieren (βB1-CTGF-Mäuse), mit Wildtyp-Tieren des FVBN-Stamms verpaart. Hierdurch wurde gewährleistet, dass bei der Analyse der transgenen Tiere jeweils Wildtypkontrollen aus dem gleichen Wurf zur Verfügung standen. Neue Würfe wurden drei Wochen nach Geburt geschlechtlich getrennt in neue Käfige überführt und anschließend genotypisiert. Die Tötung der Tiere erfolgte immer zum gleichen Tageszeitpunkt durch Genickbruch. Die Augen wurden sogleich schonend enukleiert.
3.5.2 Genotypisierung von βB1-CTGF-Mäusen
Die Genotypisierung der Mäuse erfolgte durch PCR mit genomischer DNA aus Mausschwänzen. Hierzu wurden die Tiere mit Isofluran betäubt, mit einer sterilen Präparationsschere 0,5 cm der Schwanzspitze entfernt und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Zur Lyse des Gewebes wurden 200 µl Proteinase K Lysepuffer zugegeben und ü. N. im Schüttler bei 1.200 Upm und 55 °C lysiert. Die Inaktivierung der Proteinase K erfolgte anschließend für 15 min bei 95 °C. Unlösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugation bei 10.000 Upm für 10 min sedimentiert und der Überstand in ein neues Gefäß überführt.
Die Genotypisierungs-PCR wurde mit einem spezifischen Primerpaar durchgeführt, welches in der Lage war in der dem Konstrukt eingefügten SV40-Sequenz zu binden. Die PCR verlief nach dem in Tab. 24 angegebenen Protokoll.
Mausschwanz-PCR
Mausschwanz-PCR Cyclerprogramm
Schritt Temperatur Dauer Zyklen
Aufschmelzen 95 °C 10 s
35
Annealing 55 °C 30 s
Amplifikation 72 °C 60 s
abschl. Amplifikation 72 °C 10 min 1
Tab. 24: Reaktionsansatz und Thermocycler-Programm zur Genotypisierung von βB1-CTGF-Überexpressionsmäusen
Jeweils 15 µl des PCR-Ansatzes wurden nach dem Lauf mit 3 µl Auftragspuffer versetzt, auf ein 1 %iges Ethidiumbromid-Agarosegel geladen und die PCR-Produkte bei 120 V für 45 min aufgetrennt. Bei einem transgenen Tier waren unter UV-Licht Banden bei einer Höhe von 300 bp zu erkennen.
3.5.3 Messung des intraokulären Drucks
Die Messung des IOD bzw. Augeninnendrucks erfolgte mittels Applationstonometrie nach Goldmann (Moses 1958). Bei dieser Untersuchung wird die Kraft gemessen, die notwendig ist, die plane Vorderfläche eines Messstiftes mit definiertem Durchmesser mit der Hornhaut in Kontakt zu bringen und diese abzuplatten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein TonLab Tonometer verwendet. Bei diesem Gerät wird die Kraft des Abpralls des Messstiftes von der Cornea des Auges ermittelt. Der Endwert wird aus 6 Einzelmessungen gemittelt und in mmHg angegeben.
Da der IOD im Laufe des Tages zyklisch schwanken kann, wurden die Messungen jeweils um 13 Uhr durchgeführt, um Verfälschungen der Messergebnisse zu vermeiden. Vor der Messung wurden die Tiere durch intraperitoneale Gabe einer Mischung aus 6 – 8 mg/kg Körpergewicht Xylazin und 90 – 120 mg/kg Körpergewicht
Ketamin in tiefe Narkose versetzt. Anschließend wurden je Auge vier Endwert-messungen des Augeninnendrucks durchgeführt und die Mittelwerte aus diesen Messungen in die statistische Auswertung eingebracht.
3.5.4 CTGF-Expressionsanalyse
Die Stärke der CTGF-Expression im Auge der einzelnen Linien wurde durch Analyse der mRNA-Expression in der Linse sowie im restlichen Auge mittels Northern Blot bestimmt. Bei der im Weiteren analysierten Linie 5 wurde zudem der tatsächliche CTGF-Gehalt im KW durch Western Blot-Analyse quantifiziert.
Zur Entnahme des KW wurden die bei Punkt 3.5.3 bereits narkotisierten Tiere verwendet. Mit einer 34-Gauge-Nadel, die über einen dünnen Schlauch mit einer Hamilton-Spritze verbunden war, wurde die vordere Augenkammer punktiert und das KW abgezogen. Anschließend wurden die Tiere durch Genickbruch getötet und die Augen für die Extraktion der RNA wie unter 3.3.1 beschrieben entnommen.
Um ausreichend Ausgangsmaterial für weitere Untersuchungen zu erhalten wurden KW und Gewebeproben von jeweils vier transgenen, bzw. Wildtyptieren aus einem Wurf vereinigt. Sofern die weitere Verarbeitung nicht sofort erfolgte, wurden die Proben in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert.
3.5.5 Herstellung von immunhistochemischen Präparaten
Für die Herstellung von Gefrierschnitten wurden die entnommenen Augen für 1 h in PFA-Fixierlösung (4 % (w/v) Paraformaldehyd in PBS) fixiert. Anschließend wurden die Augen mit PBS gespült und halbiert. Hierdurch konnte die Linse leicht entfernt werden, welche beim späteren Gefrierschneiden leicht brechen würde. Zur Stabilisierung der Gewebe wurden die Augen jeweils für 4 h bei RT mit aufsteigenden Konzentrationen einer Sucrose-Lösung (10 % (w/v) Sucrose in 0,1 M Phosphatpuffer;
20 % (w/v) Sucrose in 0,1 M Phosphatpuffer und 30 % (w/v) Sucrose in 0,1 M Phosphatpuffer) behandelt. Anschließend wurden die Augen in Tissue-Tek®
eingebettet, direkt im Kryostat eingefroren und bei -20 °C gelagert.
3.5.6 Färbungen von Gefrierschnitten
Die Herstellung der Schnitte erfolgte mit Hilfe des Microm HM 500 OM Kryostats.
Diese wurden daraufhin auf Objektträger aufgenommen, kurz bei RT angetrocknet und für 1 - 5 min mit 0,1 M Phosphatpuffer gespült, wodurch das Einbettmedium entfernt wurde. Anschließend wurden die Schnitte mit einem Fettstift (PapPen) umrandet. Danach wurden sie für 1 h bei RT auf dem Schüttler blockiert.
Anschließend wurde die Lösung von den Schnitten entfernt und der Primärantikörper (verdünnt in 1:10 Blockierungslösung in 0,1 M Phosphatpuffer) wurde auf die Schnitte gegeben. Die Negativkontrolle wurde nur mit 1:10 Blockierungslösung inkubiert. Nach der Inkubation ü. N. bei 4 °C wurden die Schnitte für 3 x 5 min in 0,1 M Phosphatpuffer gewaschen. Danach wurde der fluoreszenzgekoppelte Sekundärantikörper (verdünnt in 1:10 Blockierungslösung mit 0,1 M Phosphatpuffer) auf die Schnitte pipettiert und 45 min im Dunkeln bei RT inkubiert. Darauf folgte ein weiterer Waschschritt für 3 x 5 min in 0,1 M Phosphatpuffer. Abschließend wurden die Schnitte mit 1:10 DAPI in Fluorescent Mounting Medium eingedeckelt und bis zur Analyse der Gewebe bei 4 °C gelagert.