Im Chemischen Screening wurden im Rahmen dieser Arbeit insgesamt 56 Pilzstämme untersucht, deren Herkunft sich in drei Teilbereiche gliedert:
in Braunschweig isolierte endophytische Pilze: 11 Stämme in Göttingen isolierte endophytische Pilze: 44 Stämme ein Pilz aus der Göttinger Stammsammlung: A6651 2.1. In Braunschweig isolierte endophytische Pilzstämme
Die aus Braunschweig stammenden endophytischen Pilze wurden im Arbeitskreis AUST
(TU Braunschweig) aus Algen und Pflanzen mariner Biotope isoliert. Dabei sortierte man ubiquitär verbreitetete Pilzgattungen wie Alternaria, Fusarium und Aspergillus in der Regel im Rahmen einer Vorauswahl aus, da hier die Gefahr, auf bekannte Metabolite zu treffen, besonders hoch ist. In Ausnahmefällen, wenn z. B. auffällige morphologische Merkmale zu Tage traten, kamen auch als Ubiquitisten bekannte Pilze in die weitere Bearbeitung. Gemäß den Projektvorgaben sollten die isolierten Pilzstämme in Braunschweig kultiviert und Extrakte an die BASF AG zum Test abgegeben werden. Aus auffälligen Stämmen sollten die Arbeitsgruppen ZEECK (Universität Göttingen) und KROHN (Universität Paderborn) dann die für die Wirkung verantwortlichen Metabolite isolieren.
Der Schwerpunkt der Arbeiten bei uns sollte dabei in der Strukturaufklärung sowie in der Verbreiterung des Metabolitenprofils interessanter Pilzstämme durch Anwendung des OSMAC-Ansatzes liegen. Für die Isolierung neuer Substanzen sollte hauptsächlich auf in Braunschweig erstellte Rohextrakte zurückgegriffen werden.
Da zu Beginn des Projektes noch keine positiven Testergebnisse vorlagen und wir aus Braunschweig kaum Rohextrakte erhielten, wurden, um die Suche nach biologisch aktiven Mikroorganismen zu beschleunigen, elf der in Braunschweig isolierten endophytischen Pilze im Chemischen Screening untersucht. Sechs dieser Stämme zeigten ein auffälliges Metabolitenmuster und kamen in die weitere Bearbeitung (siehe Kapitel A.III.). Eine Übersicht über die aus Braunschweig erhaltenen Stämme und die mit diesen erzielten Ergebnisse gibt Tabelle 1.
Stamm-Nr. Taxon Herkunft isolierte Substanzen
6288 Microsphaeropsis sp. Ceramium sp.,
Ostsee bei Travemünde 2 Spiciferone (17 und 18) 4 α-Pyrone (22 – 25) 4 Betaenone (39 – 42) 3 Solanapyrone (48, 49, 51) 6303 Ascotricha chartarum Fucus sp.,
Nordsee bei Cuxhaven Ergosterol (74) 6325 nicht sporulierend Fucales serratus
Mittelmeer, Mallorca
2 Furane (75 und 76) Phenylessigsäure (77) 6587 Alternaria sp.
(großsporig) Enteromorpha linza,
Ostsee bei Ahrenshop identisch mit Stamm 6588 6588 Alternaria sp. Enteromorpha linza,
Ostsee bei Ahrenshop Alternariol (55)
Alternariol-9-methylether (56) 3 Perylenchinone (57 – 59)
Sphaerolon (70) 3 Naphtalene (64, 65, 69) 6615 Phomopsis sp. Sanddorn,
Ostsee bei Ahrenshop
2-Phenylethanol (78) Tryptophol (79) 6634 nicht sporulierend Salsola kali
Ostsee bei Ahrenshoop 6660 Arthrinium sp. Artemisia vulgaris
Ostsee bei Ahrenshoop 6747 Ascochyta sp. Achillea mallifolia,
Ostsee bei Wustrow 6768 Diaporthe sp. Salix vinimalis,
Ostsee bei Wustrow 6907 Fusarium sp. Fucus vesiculosus,
Nordsee bei Cuxhaven
Tabelle 1: Zusammenfassung der Ergebnisse für die in Braunschweig isolierten Pilzstämme.
2.2. In Göttingen isolierte endophytische Pilzstämme
Eine Rotalge aus einer Bucht in der Nähe von Kissamos (Kreta, Griechenland) sowie eine weitere Rotalge von der Insel Gozo (Malta) waren das Material für die Isolierung von 44 endophytischen Pilzen in Göttinger Regie. Bei den beiden Algen handelt es sich sehr wahrscheinlich um dieselbe Spezies: Gracillaria tikvahiae (Dr.SCHULZ, TU Braunschweig).
Um aus Algen endophytischen Pilze zu erhalten, wurde zunächst die Oberfläche nach der von B. SCHULZ et al. beschriebenen Methode55 sterilisiert. Dazu wurden die Algen für 30 Sekunden in eine 70%ige Ethanollösung getaucht und anschließend mit sterilem Wasser gewaschen. Um den Erfolg der Oberflächensterilisation zu kontrollieren, drückte man die Algen kurz auf Agarplatten, die dann inkubiert wurden.
Die sterilisierten Algen wurden in kleine Stückchen zerschnitten und auf Agarplatten aufgebracht. Als Isolierungsmedien dienten verschiedene Medien sowohl ohne als auch mit Zusatz von Natriumchlorid (33 g/L). Um das Anwachsen von Bakterien zu verhindern, wurden den Medien jeweils 250 mg/L Penicillin G und 250 mg/L Streptomycin zugesetzt.
Nach zwei bis drei Tagen waren erste Pilzkolonien zu erkennen, die mehrmals vereinzelt wurden. Nach dieser Methode konnten aus den von Kreta und Gozo stammenden Algen 11 bzw. 33 endophytische Pilze isoliert werden. Die Bestimmung der einzelnen Pilze erfolgte durch Dr. DRAEGER (Arbeitskeis AUST, TU Braunschweig) nach morphologischen Gesichtspunkten.
Die endophytischen Pilze wurden im Chemischen Screening untersucht und die Extrakte an die BASF AG zur Prüfung der biologischen Aktivität übergeben. Dabei fielen einige Extrakte im Mikrotest durch fungizide Aktivität gegen einen oder mehrere der vier Testorganismen Phytophthora infestans, Botrytis cinerea, Pyricularia oryzae und Septoria tritici auf. Eine Übersicht über die aus den beiden Algen isolierten endophytischen Pilze ist in den Tabellen 2 und 3 dargestellt.
Testorganismen: P. infestans (PHYTIN), B. cinerea (BORTR), P. oryzae (PYRIOR) und S. tritici (SEPTTR)
Tabelle 2: Zusammenfassung der Bearbeitung Göttinger Pilzstämme aus der bei Kreta gesammelten Alge.
Stamm-Nr. Taxon Aktivität imMikrotest
(fungizid) der BASF AG Chemisches Screening
Gö 100/1 Aspergillus niger -
Gö 100/2 Chaetomium sp. PHYTIN + + +
Gö 100/3 Phoma sp. PHYTIN +
Gö 100/4 Aspergillus flavus PHYTIN + + +
Gö 100/5 Aspergillus niger -
Gö 100/6 Penicillium sp. PYRIOR +
Gö 100/7 Nodulisporium sp. PYRIOR + +
Gö 100/8 Dendryphiella sp. PYRIOR -
Gö 100/9 Chaetomium sp. PHYTIN, SEPTTR + + +
Gö 100/10 Chaetomium sp. PYRIOR +
Gö 100/11 Chaetomium sp. PHYTIN + + +
Testorganismen: P. infestans (PHYTIN), B. cinerea (BORTR), P. oryzae (PYRIOR) und S. tritici (SEPTTR)
Tabelle 3: Zusammenfassung der Bearbeitung Göttinger Pilzstämme aus der bei Gozo gesammelten Alge.
Durch die eigenständige Isolierung endophytischer Pilze gab es mehr Pilzstämme deren Inhaltsstoffe im Chemischen Screening und/ oder durch eine biologische Aktivität auffielen.
Dies ermöglichte es Ranglisten zu erstellen und gezielt besonders interessante Stämme zu bearbeiteten. Die zum Einsatz kommenden Auswahlkriterien wurden bereits im Kapitel A.I.1. dargelegt, besonders wichtig war dabei die Korrelation zwischen biologischer Aktivität
Stamm-Nr. Taxon Aktivität imMikrotest (fungizid) der BASF AG
Chemisches Screening
Gö 101/1 Aspergillus niger +
Gö 101/2 Aspergillus flavus PHYTIN + +
Gö 101/3 leere Ascocarpe, nicht bestimmbar
-
Gö 101/4 Aspergillus alliaceus -
Gö 101/5 Aspergillus niger -
Gö 101/6 Penicillium sp. +
Gö 101/7 Aspergillus flavipes PHYTIN, PYRIOR + +
Gö 101/8 Dendryphiella sp. -
Gö 101/9 Aspergillus niger + +
Gö 101/10 Aspergillus flavipes PHYTIN + +
Gö 101/11 Penicillium sp. PYRIOR + +
Gö 101/12 Dendryphiella sp. -
Gö 101/13 Penicillium sp. PHYTIN, PYRIOR, SEPTTR + +
Gö 101/14 Aspergillus flavus PYRIOR + + +
Gö 101/15 Aspergillus niger + +
Gö 101/16 Aspergillus melleus -
Gö 101/17 nicht sporulierend -
Gö 101/18 Fusarium sp. +
Gö 101/19 Trichoderma sp. PHYTIN, PYRIOR + +
Gö 101/20 Aspergillus ochraceus -
Gö 101/21 Chaetomium sp. -
Gö 101/22 Aspergillus niger +
Gö 101/23 Eurotium sp./ Aspergillus glaucus-Gruppe
+
Gö 101/24 Dendryphiella sp. -
Gö 101/25 Dendryphiella sp. -
Gö 101/26 Humicola grisea PYRIOR, SEPTTR + +
Gö 101/27 Aspergillus ustus PHYTIN, PYRIOR +
Gö 101/28 Sporormiella sp. -
Gö 101/29 Drechslera sp. PHYTIN, PYRIOR, SEPTTR + + +
Gö 101/30 Verticillium cinnabarinum -
Gö 101/31 Aspergillus versicolor +
Gö 101/32 Dendryphiella sp. -
Gö 101/33 nicht sporulierend -
und Chemischen Screening. Außerdem befanden sich unter den isolierten Stämmen auch ubiquitär verbreitetete Pilze wie Aspergillus sp. und Penicillium sp., die nur bearbeitet wurden, wenn die biologische Aktivität durch einen HPLC-Mikrotest bestätigt werden konnte. Durch dieses Vorgehen sollte eine gezielte Isolierung der aktiven Komponenten ermöglicht werde.
Das Metabolitenmuster der in Göttingen isolierten endophytischen Pilze wird in Kapitel A.IV.
beschrieben. Eine Übersicht über die bearbeiteten Stämme und die mit diesen erzielten Ergebnisse gibt Tabelle 4.
Stamm-Nr. Taxon Herkunft isolierte Substanzen
Gö 100/2 Chaetomium sp. Alge von Kreta Chaetocyclinone A – C (82 – 84) Gö 100/4 Aspergillus flavus Alge von Kreta Kojic acid (91)
2 Miyakamide (92 und 93) Arthrographol (96)
Arthrolacton (98) Gö 100/9 Chaetomium sp. Alge von Kreta Orsellinsäure (100)
Orsellide A – E (101, 102, 104, 105 und 106) 2 Orsellinsäureester (107 und 108) 3 Thiodiketopiperazine (119 – 121)
Fumitremorgin C (125) Gö 101/19 Trichoderma sp. Alge von Gozo Sorbicillin (126)
Gö 101/26 Humicola grisea, Alge von Gozo 6-Methoxysterigmatocystin (127) Fuscoatrosid (128)
Tabelle 4: Zusammenfassung der Ergebnisse für die in Göttingen isolierten Pilzstämme.
2.3. Der Stamm A6651
Der aus der Göttinger Stammsammlung stammende Pilz A6651 wurde zu Beginn dieser Doktorarbeit bearbeitet, da noch keine im Rahmen des BMBF-Projektes isolierten Endophyten für Untersuchungen zur Verfügung standen. Im Rahmen einer Kooperation mit der Firma Hoechst (heute: Sanofi-Aventis) konnte S.PHILIPS Dihydrobipolaroxin (129) aus Kulturen des Stammes isolieren. In der vorliegenden Doktorarbeit sollte untersucht werden, ob der Stamm A6651 durch Variation der Fermentationsbedingungen zur Produktion weiterer Sekundärmetabolite angeregt werden kann. Das Metabolitenmuster dieses Stammes wird in Kapitel A.V.1. beschrieben.
III Sekundärmetabolite in Braunschweig isolierter endophytischer Pilze