Zur Detektion von Proteinen mittels Lichtmikroskopie braucht es sowohl eine spezifische Markierung als auch ein Mikroskop mit ausreichender Auflösung. Dies kann in vivo durch Fusion der zu untersuchenden Proteine mit Fluoreszenzproteinen wie GFP (green fluorescent protein), mit RSFPs (reversibly switchable fluorescent proteins) sowie durch Addition eines Fluorophor-bindenden Markers (SNAP-, CLIP- und Halo-Technologie) mit anschließender Färbung durchgeführt werden (Stagge et al. 2013). Diese Methoden funktionieren auch in fixierten Präparaten, wobei hier eine Vielzahl anderer Möglichkeiten der spezifischen Markierung vorhanden ist. Neben der konventionellen indirekten Immunfluoreszenz mit einem Primär- und mehreren Fluorophor-gekoppelten Sekundärantikörpern stehen weitere Proteine zur Antigenerkennung zur Verfügung (unter anderem DARPins, Nanobodies und Affibodies).
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Um die markierten Proteine betrachten zu können, bedarf es neben der spezifischen Färbung ebenfalls ein Mikroskop mit ausreichend guter Auflösung, wie Ernst Abbé mit seiner theoretisch berechneten Auflösungsgrenze der Lichtmikroskopie deutlich machte. Er errechnete, dass zwei Objekte die näher als die halbe Wellenlänge des Lichts voneinander entfernt sind, durch konventionelle Lichtmikroskopie nicht voneinander getrennt werden können, sondern als ein einziges, beugungsbegrenztes Objekt abgebildet werden. Diese Auflösung ist dabei durch die Fokussierung des Lichtstrahls und der auftretenden Beugung aufgrund des Wellencharakters von Licht auf etwa 250 nm limitiert. In der von Abbé entwickelten Formel zur Berechnung der Auflösungsgrenze ist d proportional zur Wellenlänge des Lichts 𝜆 (𝜆= 400–700 nm) und korreliert invers mit der numerischen Apertur (𝑛 sin 𝛼) des Mikroskops, wobei 𝑛 für den Brechungsindex des Mediums und 𝛼 für den halben Öffnungswinkel des Objektivs steht.
𝑑 = 𝜆
2 𝑛 sin 𝛼
Für die Untersuchungen sub-mitochondrialer Proteinverteilungen sind allerdings höhere Auflösungen notwendig, da bereits der Durchmesser von Mitochondrien typischerweise zwischen 250 und 500 nm rangiert und damit nur knapp über der Auflösungsgrenze eines konventionellen Lichtmikroskops von etwa 250 nm liegt. Eine detaillierte Betrachtung der Proteinverteilung dieser Organellen ist demnach ohne verbesserte Auflösung nur in Ausnahmefällen möglich (Jakobs and Wurm 2014).
Um die Auflösungsgrenze von Abbé zu durchbrechen, wurde in den letzten Jahren eine Reihe von Fluoreszenzmikroskopie-Verfahren entwickelt, die nicht auf bessere Fokussierung des Lichtstrahls beruhen. Stattdessen nutzen sie alle das Prinzip des Schaltens zwischen zwei molekularen Zuständen, meist einem fluoreszierenden und einem nicht-fluoreszierenden Zustand. Diese neuen Methoden lassen sich in zwei Kategorien einteilen, die stochastischen Methoden wie GSDIM (ground state depletion microscopy followed by individual molecule return) (Folling et al. 2008) und PALM (photoactivated localization microscopy) (Betzig et al. 2006), sowie die Methoden mit gezieltem Auslesen der Fluoreszenz wie STED (stimulated emission depletion). In der Theorie haben diese neuen Verfahren eine unlimitierte maximalen Auflösung (Abbildung 1.13).
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Abbildung 1.13: Darstellung der Unterschiede zwischen den stochastischen und den gezielten hochauflösenden Mikroskopieverfahren. A.) Bei gezielten Mikroskopieverfahren wie STED können Objekte bestehend aus einer bestimmten Anzahl an fluoreszierenden Molekülen („B“) durch das koordinierte Scannen mit einem Anregungsstrahl (grün) und einem Abregungsstrahl (rot) beugungsunbeschränkt aufgenommen werden. Durch den ringförmigen STED-Strahl werden die Fluorophore in der Peripherie ausgeschaltet, wodurch lediglich Photonen aus dem Fokuszentrum der Probe emittiert werden.
Auch Methoden wie PALM nutzen das Schalten zwischen einem nichtfluoreszierenden und einem fluoreszierenden Zustand.
Welche Moleküle sich im aus- beziehungsweise an-Zustand befinden geschieht bei diesen Verfahren allerdings stochastisch.
(bearbeitet aus (Hell 2007)) B.) Gezeigt ist die verbesserte Auflösung der STED-Mikroskopie anhand der Proteinverteilung in Mitochondrien. (Größenbalken: 2 µm)
Das Prinzip der STED-Mikroskopie wurde theoretisch 1994 durch Hell und Wichmann beschrieben und wenige Jahre später praktisch umgesetzt (Hell and Wichmann 1994, Klar et al. 2000). Bei diesem gezielten Mikroskopieverfahren wird die Emission der Fluorophore am Rande des Fokuspunktes mittels eines ringförmigen Laserstrahls unterdrückt, dessen Wellenlänge am roten Ende des Emissionspektrums der jeweiligen Fluorophore liegt.
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Abbildung 1.14: Prinzip von Anregung- und STED-Strahl. Fluorophore können von ihrem Grundzustand S0 durch Licht einer bestimmten Wellenlänge in ihren angeregten Zustand S1 versetzt werden. Nach einer gewissen Lebensdauer fallen sie in den Grundzustand zurück und emittieren dabei jeweils ein Photon einer charakteristischen Wellenlänge. Der STED-Strahl führt zu Unterdrückung dieser Fluoreszenzemission, indem es die Fluorophore durch stimulierte Emission dazu bringt, von S1 in S0
überzugehen indem sie ein Photon einer deutlich anderen Wellenlänge emittieren (A). Diese stimulierten Photonen können optisch von den Fluoreszenzphotonen getrennt werden. Während der Anregungsstrahl (B, blau) die Fluorophore im Zentrum des Fokus anregt, wird ein ringförmiger STED-Strahl benutzt um die Fluoreszenz in der Peripherie durch stimulierte Emission zu verhindern. Dies erhöht die effektive Auflösung (dargestellt durch die PSF (point spread function)) (bearbeitet aus (Hell 2003, Willig et al. 2006)).
Der ringförmige STED-Strahl führt dazu, dass Fluorophore am Rand des Fokus durch stimulierte Emission abgeregt werden, indem sie ein Photon der gleichen Wellenlänge wie die des STED-Strahls emittieren.
Dadurch fallen die Fluorophore von S1 auf einen höheren Vibrationslevel des Grundzustands S0 zurück, wodurch eine Wiederanregung verhindert werden kann (Abbildung 1.14 A). Die nachstehende Formel erklärt das Prinzip der verbesserte Auflösung durch den STED-Strahl.
𝑑 ≈ 𝜆
2 𝑛 sin 𝛼√1 + a 𝐼𝑚𝑎𝑥⁄𝐼𝑠
Hierbei ist 𝐼𝑚𝑎𝑥 die Intensität des STED-Strahls, 𝐼𝑠 ist die „Sättigungsintensität“ und a> 0 ein Parameter, welcher die Form des Nullpunktes (punkt- oder linienförmig) berücksichtigt. Wird ein Abregungsstrahl mit der Intensität 𝐼𝑚𝑎𝑥 einer bestimmten Wellenlänge genutzt, werden die Fluorophore am Rand des Fokus, die nicht im zentralen Bereich des Strahls liegen, ausgeschaltet. Die „gesättigte Intensität“ 𝐼𝑠ist eine Farbstoff-spezifische Konstante, die charakteristisch vom Schaltvorgang abhängt und negativ mit der Lebensdauer der Zustände korreliert. Während für 𝐼𝑚𝑎𝑥 = 0 die Auflösung 𝑑 der beugungsbeschränkten Formel von Abbé folgt, kann bei 𝐼𝑚𝑎𝑥⁄ → ∞ eine theoretisch unlimitierte Auflösung erreicht werden 𝐼𝑠 (Hell 2009). Die Anordnung der Strahlen (punktförmige Anregung sowie ringförmiger STED-Strahl) im Mikroskop sowie die daraus resultierende effektive Auflösung sind in Abbildung 1.14 B dargestellt.
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