Gold-Nanopartikel–DNA-Tweezers

Treibstoffstrang gleichzeitig an beide Arme eines Tweezers hybridisiert, kann die Topologie so sein, dass eine vollst¨andige Hybridisierung sterisch behindert ist aufgrund der helikalen Natur der Duplex-DNA. Die niedrigen und mittleren FRET-Effizienz-Werte k¨onnen zum Teil auch aufgrund Dimerbildung von unvollst¨andig markierten Tweezers entstehen - eine Situation, die selbst durch PIE-Experimente nicht ausgeschlossen werden kann.

Mit Einzelmolek¨ulspektroskopie ist es m¨oglich, Informationen ¨uber die tats¨achlich vorliegen-den Strukturen der DNA-Tweezers im offenen und geschlossenen Zustand zu gewinnen. Die verwendeten Fluoreszenzmarkierungen sind an Stellen angebracht, die die Funktion der Twee-zers optimal beobachten lassen. Die FRET-Effizienz ist sehr hoch im geschlossenen Zustand (90%) und geht auf praktisch Null im offenen Zustand. Um die Dynamik der Tweezers in den offenen und geschlossenen Zust¨anden zu untersuchen, sollte das FRET-Signal in diesen Konformationen etwa 50% betragen. Daher sind neue DNA-Konstrukte mit den Fluores-zenzfarbstoffen an anderen Stellen notwendig, die sensibler auf ¨Anderungen im FRET-Signal sind, um die Dynamik der Tweezers in den verschiedenen Zust¨anden zu untersuchen. Aus den Einzelmolek¨ulmessungen mit PIE k¨onnen wir unterschiedliche Subpopulationen aufl¨osen.

Obwohl unterschiedliche Oligomere auch in der Polyacrylamid-Gelelektrophorese beobachtet wurden, k¨onnen wir mit den Einzelmolek¨ulmessungen die FRET-Effizienz der verschiedenen Subpopulationen bestimmen und so Zusatzinformationen ¨uber die Strukturen dieser Sub-populationen gewinnen. Außerdem sind die FRET-Effizienzen, die wir f¨ur die geschlossenen und die offenen Tweezers bestimmen, nicht durch unvollst¨andige Fluoreszenzmarkierung oder die mittlere Subpopulation beeinflusst. Im Gegensatz zu Werten, die aus Ensemblemessun-gen stammen, k¨onnen die spFRET/PIE-Effizienzen verwendet werden, um die Entfernung zwischen den Farbstoffen angemessen zu bestimmen.

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 abs. / emission (a.u.) 0.0

700 600

500 400

300

λ (nm)

5nm Au-nano part. abs.

Oregon green 488 abs.

Oregon green 488 em.

plasmon band

Abbildung 5.7: Absorptionsspektrum der Streptavidin-beschichteten 5 nm Gold-Nanopartikel (rot) sowie Absorptions- und Emissionsspektrum des Fluoreszenzfarbstof-fes Oregon Green 488 (blau bzw. gr¨un). Deutlich zu erkennen ist der Peak der Plasmon-Resonanz im Absorptionsspektrum des Gold-Nanopartikels. Die-ser f¨allt in denselben Wellenl¨angenbereich wie die Emission von Oregon Green 488.

6.6 6.4 6.2 6.0 5.8

6 Intensity (10 cps) 5.6

3000 2000

1000 0

t (s)

+F +F

+F

Abbildung 5.8: Verlauf der Fluoreszenzemission der Gold-Nanopartikel–DNA-Tweezers beim Schalten zwischen der offenen und der geschlossenen Konfiguration durch Zu-gabe der entsprechenden Treibstoffstr¨ange.

”geschlossenen“ Konfiguration grob absch¨atzen:

dopen ≈ 2rstrep+

R²_ss24+dTweezers (5.3)

d_closed ≈ 2r_strep+l_ds18 (5.4)

2rstrep ≈ 1.75 nm ist die mittlere Dicke der Streptavidinmolek¨ule auf der Goldoberfl¨ache, R²_ss24 ist der mittlere End-zu-End-Abstand des 24 Basen-langen DNA-Einzelstrangab-schnitts,dTweezers der mittlere Abstand zwischen dem Farbstoff und dem anderen Arm der Tweezers (nach den spFRET-Messungen k¨onnen wir einen Wert von 9 nm annehmen, vgl. Ka-pitel5.1.3) und l_ds18≈6.1 nm die L¨ange einer 18-Basenpaar-Doppelhelix. Nach dem Modell des halbsteifen Polymers (Kapitel3.1.1) k¨onnen wir

R_ss24² nach Gleichung3.4 approximie-ren durch√

2L·L_P= 4.5 nm, wobei L= 24·0.43 nm = 10.3 nm ist und die Persistenzl¨ange von ssDNA LP = 1 nm verwendet wird. Insgesamt kann der Abstand zwischen Farbstoff und Goldoberfl¨ache bei der offenen Konfiguration im Bereich von 0–24 nm variieren, wobei die Goldoberfl¨ache weitgehend durch Streptavidin bedeckt ist, was zu einem Mindestabstand von etwa 3.5 nm f¨uhrt. Nach Gleichung 5.3erhalten wir mit diesen Werten einen

”mittleren Abstand“ von etwa 17 nm, der sich im geschlossenen Zustand nach Gleichung5.4 auf etwa 10 nm verk¨urzt.

Teilweise ist der Fluoreszenzr¨uckgang reversibel und durch Zugeben des komplement¨aren Treibstoffstranges steigt die Fluoreszenz wieder an, da sich einige Tweezers ¨offnen. Als Haupt-ursache, dass die Fluoreszenz das Ausgangsniveau nicht wenigstens ann¨ahernd erreicht, wird hierbei der Unterschied gesehen, dass bei den Hybridtweezers der eine Seitenarm fest am Gold-Nanopartikel angebunden ist und dadurch unter Umst¨anden im geschlossenen Zustand die Haltepunktsequenz durch die Anwesenheit des Nanogolds f¨ur den zweiten Treibstoffstrang nicht so leicht zug¨anglich ist wie bei den freien DNA-Tweezers (vgl. Abb.3.8). Außerdem be-steht die M¨oglichkeit, dass mehrere DNA-Tweezers auf einem einzigen Gold-Nanopartikel gebunden sind. Diese k¨onnen ¨uber zugef¨ugte Treibstoffstr¨ange quervernetzt werden. Dieses Crosslinking wurde auch bei den

”normalen“ Tweezers beobachtet (Kapitel 5.1.2und5.1.3).

Dort war es verantwortlich f¨ur die Bildung von Dimeren und Multimeren. Bei den Hybridt-weezers ist es eine m¨ogliche Ursache daf¨ur, dass quervernetzte Tweezers nach der Zugabe des komplement¨aren Treibstoffstrangs nicht mehr vollst¨andig ge¨offnet werden. Zu den genannten Ursachen f¨ur die nicht vollst¨andige Reversibilit¨at kommen die in Kapitel5.1.1genannten.

Abb. 5.8 zeigt ein hohes Hintergrundsignal. Hierf¨ur gibt es zwei naheliegende Gr¨unde: zum einen sind die erwarteten mittleren Abst¨ande zwischen Goldoberfl¨ache und dem Farbstoff Oregon Green 488 hoch (≥ 10 nm). Dadurch wird kein starkes

”Quenchen“ erwartet. Zum anderen liegt es an dem (unbeabsichtigten) massiven ¨Uberschuss an DNA-Tweezers gegen¨uber den Streptavidin-Goldpartikeln (siehe Kapitel3.2.2), der zur Folge hat, dass nur ein Bruchteil der Tweezers (und damit der Farbstoffe) an ein Gold-Nanopartikel gebunden ist. Die frei in L¨osung vorkommenden Farbstoffe k¨onnen somit mit praktisch konstanter Intensit¨at emittie-ren ohne, dass sie dabei durch Treibstoffstr¨ange beeinflusst w¨urden.

Die durchgef¨uhrten Messungen sind einfache Ensemblemessungen und zeigen, dass Gold-Nanopartikel erfolgreich als Quencher f¨ur Fluoreszenzfarbstoffe in DNA-Nanoaktuatoren ein-gesetzt werden k¨onnen, um Abstands¨anderungen≥10 nm zu verfolgen. Es fehlen zum einen wesentliche Kontrollexperimente, um diese Erkenntnisse abzusichern, zum anderen sind die Abst¨ande bei dieser Verwendung der Tweezers aufgrund ihrer Struktur nicht pr¨azise

defi-Monomere Dimere

DNA-Nanogold

Abbildung 5.9: Gelnachweis der Bindung des Gold-Nanopartikels an den Devicestrang. Die linke Bahn enth¨alt ausschließlich den Devicestrang. Neben der Monomerban-de tritt eine obere BanMonomerban-de auf, die Dimeren zugeordnet werMonomerban-den kann (siehe Text). Die rechte Bahn des Gels zeigt den Devicestrang nach der Reaktion mit Monomaleimido-Nanogold. Im oberen Bereich dieser Bahn sehen wir mehrere Banden, die DNA-Nanogold-Verbindungen zugeordnet werden k¨onnen.

niert, und wir argumentieren auf der Basis von mittleren Abst¨anden (Hier k¨onnten Einzelmo-lek¨ulexperimente Abhilfe schafften). Schließlich kann man nicht exakt kontrollieren, wieviele DNA-Tweezers an ein Streptavidin-Goldpartikel angebunden sind. Um den beiden letztge-nannten Problemen zu begegnen, wurde in der Folge der “DNA-Stepper“ entwickelt und untersucht.