Zur Erfassung der GSL-Variation und des Befalls mit spezialisierten Stängelschädlingen wurden dreijährige Versuche an je vier Standorten mit einem 30 Genotypen umfassen-den Prüfsortiment als Blockversuch durchgeführt (Tabelle 2.1). Die Aussaat erfolgte in Einzelkornsaat. Aussaat-, Dünge-, Herbizid-, Fungizid- und ergänzende Pflegemaßnah-men wurden ortsüblich durch die jeweiligen Versuchsbetriebe durchgeführt. Auf Insek-tizidbehandlungen wurde mit Hinblick auf die Versuchsfragestellung verzichtet.
Tabelle 2.1: Aufbau der Versuchsserie 2011 bis 2013 (Abkürzungen der Standorte in Klammern)
Faktor Anzahl Stufen
Jahre (J) 3 2011, 2012, 2013
Standorte (O) 4
Göttingen-Reinshof (RH) Göttingen-Weende (WE) Einbeck/KWS (EI) Peine/Limagrain (PE) Genotypen (G) 30 siehe Tabelle 2.2 Wiederholungen 2 (4)§
§ 2012 und 2013 4 Wiederholungen am Standort Weende
2.1.2 Material
Unter dem geprüften Material (Tabelle 2.2) befanden sich neben 15 resynthetisierten Rapslinien die Hybriden Visby und Mendel, ältere (Sollux, Liropa, Santana, Mansholt und Samourai), als auch jüngere Sorten (Express, Oase, Grizzly, Campala), sowie die wieder-holt auf sehr niedrigen GSL-Gehalt im Samen selektierte Linie GOE-1991 und drei nicht angepasste Linien (Abukuma natane, Olimpiade und Gaoyou). Kriterien für die Auswahl der Genotypen waren eine große Variabilität im Gesamtgehalt und der Zusammenset-zung der Glucosinolate in Samen und Grünmasse. Da in den Versuchen auch die Präfe-renz von Schaderregern überprüft werden sollte, war eine große Variabilität in morphologischen Merkmalen ebenfalls erwünscht. Einige der Genotypen wurden in vor-herigen Arbeiten bereits im Zusammenhang mit dem Befall des Kohltriebrüsslers von Eickermann (2008) und Eickermann et al. (2011) untersucht.
2 Material und Methoden 20
Tabelle 2.2: Prüfsortiment 2011 – 2013 (Darstellung der Resynthesen nach Girke 2002, §)2013 gegen H196 getauscht. $)2013 gegen H4 getauscht) GenotypSortentypMutter Resynthese / Klassifizierung Vater Resynthese / Beschreibung Beschreibung S30ResyntheseB. oleracea convar. capitata var. capitataB. rapa ssp. pekinensisKopfkohl x Chinakohl S3ResyntheseB. rapa ssp. rapaB. oleracea convar. acephala var. sabellicaHerbstrübe x Grünkohl S14ResyntheseB. napus var. pabularia x B. oleraceaconvar. acephala var. sabellicaB. rapa ssp. oleifera(Schnittkohl x Grünkohl) x Lembkes Rübsen L16ResyntheseB. oleracea convar. botrytis var. alboglabraB. rapa ssp. pekinensisChin. Brokkoli x Chinakohl L122ResyntheseB. oleracea convar. capitata var. sabaudaB. rapa ssp. pekinensisWirsing x Chinakohl G53ResyntheseB. oleracea convar. capitata var. capitataB. rapa ssp. nipposinica var. pervi- ridisKopfkohl x Japanischer Senfspinat H327ResyntheseB. oleracea convar. capitata var. capitataB. rapa ssp. nipposinica var. pervi- ridisKopfkohl x Japanischer Senfspinat H10ResyntheseB. oleracea convar. capitata var. capitataB. rapa ssp. pekinensisKopfkohl x Chinakohl H113ResyntheseB. oleracea convar. capitata var. sabaudaB. rapa ssp. pekinensisWirsing x Chinakohl H231$ResyntheseB. oleracea convar. capitata var. capitataB .rapa ssp. pekinensisKopfkohl x Chinakohl H4 $ResyntheseB. oleracea covar. acephala var. sabellicaB.rapa ssp. pekinensis var.laxaChinakohl x Grünkohl H30ResyntheseB. rapassp. chinensisB. napus ssp. napus var. pabulariaPok Choi x Sibirischer Kohl H65§ResyntheseB. oleracea convar. capitata var. sabaudaB. rapa ssp. pekinensisWirsing x Chinakohl H196 §ResyntheseB. oleracea convar. acephala var. gongyloidesB. rapa ssp.chinensisKohlrabi x Pok Choi H149ResyntheseB. oleracea convar. acephala var. medullosaB. rapassp. chinensisMarkstammkohl x Pok Choi R140ResyntheseB. oleracea convar. capitata var. capitataB. rapa ssp. oleiferaKopfkohl x Rübsen R53ResyntheseB. oleraceaconvar. acephala var. sabellicaB.rapa ssp. pekinensisGrünkohl x Chinakohl Abukuma natane LinieB. napus subsp. napus var. napus f. biennisHerkunft Japan (IPK CR 156), ++ Qualität GOE-1991LinieB. napus subsp. napus var. napus f. biennisDeutschland, Uni Göttingen, 00-Qualität selektiert auf Niedrig-GSL Sollux LinieB. napus subsp. napus var. napus f. biennisDeutschland, Zuchtgemeinschaft WR 1973, ++-Qualität, Hoch-GSL GaoyouLinieB. napus subsp. napus var. napus f. biennisChina aus Chinese breeding line ‘695’ x Japanese cultivar ‘Nongling 18’ ++ Qualität MendelHybride B. napus var. oleiferaDeutschland, NPZ Lembke 2001, 00-Qualität, Kohlhernie resistent Liropa LinieB. napus subsp. napus var. napus f. biennisDeutschland, DSV 1983, 00-Qualität Visby Hybride B. napus var. oleiferaDeutschland, NPZ Lembke 2007, 00-Qualität ExpressLinieB. napus var. oleiferaDeutschland, NPZ Lembke 1993, 00-Qualität OaseLinieB. napus var. oleiferaDeutschland, Linie DSV 2004, 00-Qualität Santana LinieB. napus subsp. napus var. napus f. biennisFrankreich, 00-Qualität, 1985 GrizzlyLinieB. napus var. oleiferaFrankreich, RAGT 2004, 00-Qualität DH MansholtDH LinieB. napus subsp. napus var. napus f. biennisDH-Linie aus „Mansholt's Hamburger Raps“ Niederlande 1899, ++ Qualität DH Samourai DH LinieB. napus subsp. napus var. napus f. biennisDH-Linie aus Frankreich, INRA/SERASEM 1989, 00-Qualität OlimpiadeLinieB. napus subsp. napus var. napus f. biennisItalien, Semiwintertyp, ++ Qualität IPKCR3019CampalaLinieB. napus var. oleiferaUK, Dekalb 2002, 00-Qualität
2 Material und Methoden 21
2.1.3 Probenahmen für Glucosinolatanalysen
In jedem Versuchsjahr wurden zu zwei Terminen (T1 und T2) Probenahmen für die GSL-Analysen in der Grünmasse durchgeführt (Tabelle 2.3). Um einen Zusammenhang zwi-schen Befall mit Stängelschädlingen und GSL untersuchen zu können, wurden die ersten GSL-Probenahmetermine unmittelbar mit dem beginnenden Zuflug der Rapsstängel-rüssler terminiert. Die zweiten GSL-Probenahmetermine wurden im jeweiligen Ver-suchsjahr kurz vor Blühbeginn des Sortiments durchgeführt. Damit konnten Veränderungen im GSL-Muster zwischen den beiden Probenahmeterminen verglichen werden. Sofern möglich wurden zur Samenreife auch offen abgeblühte Samenproben entnommen und GSL mit Nahinfrarotspektroskopie (NIRS) und Hochdruckflüssigkeits-chromatographie (HPLC) untersucht.
Tabelle 2.3: Aussaat- und Probenahmetermine T1 und T2 für Glucosinolatanalysen (GSL) sowie Boniturtermine für Schädlingsbefall 2011 - 2013
Jahr Standort Aussaat GSL T1 GSL T2 Befalls-
bonitur
2011
Göttingen-Reinshof 08.09.2010 Auswinterung
Göttingen-Marienstein 13.09.2010 13. April 15. Mai 5. Mai Einbeck-Rotenkirchen 02.09.2010 15. April 16. Mai 5. Mai
Peine-Hofschwicheldt 06.09.2010 Auswinterung
2012
Göttingen-Reinshof 22.08.2011 28. März 30. April 3. Mai Göttingen-Weendelsgraben 22.08.2011 27. März 30. April 8. Mai Einbeck-Rotenkirchen 02.09.2011 29. März 27. April 9. Mai
Peine-Mehrum 02.09.2011 30. März 01. Mai 10. Mai
2013
Göttingen-Reinshof 21.08.2012 19. April 21. Mai 21. Mai Göttingen-Weendelsgraben 22.08.2012 17. April 24. Mai 22. Mai Einbeck-Rotenkirchen 29.08.2012 18. April 21. Mai - Peine- Groß Bülten 30.08.2012 23. April 23. Mai 23. Mai
Aus jeder Parzelle wurden für eine Grünmassemischprobe mindestens fünf Einzelpflan-zen entnommen und in Blatt und Stängel getrennt, wie in Abbildung 2.1A exemplarisch dargestellt ist. Um die durch das breite genetische Material bedingten Unterschiede in den Entwicklungsstadien der Genotypen zu berücksichtigen, wurde jeweils von der Triebspitze des Haupttriebes ausgehend beprobt, zumal die Eiablagepunkte der Rapsstängelrüsslerweibchen ebenfalls im oberen Stängelsegment zu finden sind (Abbil-dung 2.1B). Es wurden pro Einzelpflanze maximal 15 cm Stängel und die obersten fünf voll entfalteten Blätter verwandt. Um die unterschiedliche Pflanzenentwicklung der Ge-notypen festzuhalten, wurde zu den beiden Probenahmeterminen die Pflanzenlänge ge-messen und eine Bonitur des BBCH-Stadiums durchgeführt.
2 Material und Methoden 22
Beim Trennen der Pflanzen ist eine Verletzung des Gewebes nicht vermeidbar, sodass ein GSL-Abbau durch das pflanzeneigene Enzym Myrosinase angenommen werden musste. Um diese Verluste zu minimieren, wurden die Proben unmittelbar nach Ent-nahme in Papierzweinahtflachbeutel (11,5*16cm, Artikel-Nr. 30710, Fa. Nette Papier Göttingen) überführt und auf dem Feld auf Trockeneispellets (-78 °C) gefroren. Bis zur Inaktivierung des Enzyms durch Wasserentzug in der Gefriertrocknung verblieben die Proben dementsprechend in der Gefrierkette.
2.1.4 Erfassung der Befallsparameter
Als Parameter des Befalls wurden im Rahmen der Dissertation von Schäfer-Kösterke (2015) von der Abteilung Agrarentomologie die Anzahl an Larven des Großen Rapsstän-gelrüsslers und des Gefleckten Kohltriebrüsslers pro Pflanze im Hauptrieb bestimmt. Die Bonitur wurde im Zeitfenster um die Blüte durchgeführt, bevor die Larven aus dem Stän-gel auswandern konnten (Tabelle 2.3). Dazu wurden pro Parzelle mindestens 10 Pflan-zen entnommen, deren Stängel aufgeschnitten und anschließend unter einem Binokular die Art der Larven bestimmt und ausgezählt. Als weiterer Parameter für die Entwicklung der Larven innerhalb des Stängels wurde die Länge der Fraßgänge in cm gemessen. In Verbindung mit der Pflanzenlänge zum Termin der Bonitur wurde der „Stem-Injury-Co-efficient“ (STIC) nach der Formel
𝑆𝑇𝐼𝐶 =𝐹𝑟𝑎ß𝑔𝑎𝑛𝑔𝑙ä𝑛𝑔𝑒 [𝑐𝑚]
𝑃𝑓𝑙𝑎𝑛𝑧𝑒𝑛𝑙ä𝑛𝑔𝑒 [𝑐𝑚]
berechnet. Er stellt somit den von den Larven minierten, prozentualen Anteil an der Ge-samtlänge des Stängels dar. Weitere Einzelheiten sind der Dissertation von Schäfer-Kös-terke (2015) zu entnehmen.
Abbildung 2.1: A) Trennung einer Einzelpflanze in Blatt und Stängel bei der GSL-Probenahme B) Einstichstellen der Stängelrüsslerweibchen (Göttingen-Weende, März 2012)
2 Material und Methoden 23
2.1.5 Auswertung
Die varianzanalytische Auswertung der Versuche erfolgte mit der Software PLABSTAT Version 3Bwin (Utz 2005). Zunächst erfolgte die Verrechnung der Einzelorte als vollstän-dig randomisierter Blockversuch. Schließlich wurde mit den Mittelwerten der Umwelten eine Verrechnung als Serie über Umwelten mit gepoolten Fehlervarianzen durchgeführt.
Für die Auswertung der dreijährig angelegten Versuche über Jahre und Orte wurde jede Jahr-Standort Kombination als Umwelt betrachtet, da die Anzahl der Standorte aufgrund von Auswinterungsschäden in zwei von drei Jahren nicht konstant war. Im zugrunde ge-legten Modell setzte sich dabei der Beobachtungswert xij des i-ten Genotyps in der j-ten Umwelt im betrachteten Merkmal additiv aus folgenden Parametern zusammen:
Die Genotypen wurden dabei als fixer, die Umwelten als zufälliger Faktor definiert. Im Teil GSL-Variation (Kapitel 3.1) waren für die Grünmasse-GSL am Termin T1 (T2) in der finalen Auswertung 10 (9) Umwelten eingeschlossen. Für die Samen-GSL umfasste die Zahl der Umwelten 5. Zwei Genotypen mussten zur Aussaat 2012 aufgrund von Saatgut-mangel getauscht werden, sodass in der Verrechnung der Serie die Anzahl der Prüfglie-der bei 28 lag. PLABSTAT schätzt die Heritabilität h² nach folgenPrüfglie-der Formel (Falconer &
Mackay 1996):
ℎ²𝑖𝑤𝑠=𝑉𝐺
𝑉𝑃= 𝜎𝑔2 𝜎𝑔2+𝜎𝑔𝑢2
𝑢 + 𝜎𝑒2 𝑢𝑟
mit ℎ²𝑖𝑤𝑠 Heritabilität im weiteren Sinn
𝑉𝑃 Phänotypische Varianz der Mittelwerte 𝑉𝐺 = 𝜎𝑔² Genotypische Varianz der Mittelwerte
𝜎𝑔𝑢² Varianz der Genotyp-Umwelt Interaktion 𝜎𝑒² Fehlervarianz
𝑢 Anzahl Umwelten 𝑟 Anzahl Wiederholungen
Für multiple Mittelwertvergleiche wurde sofern nicht anders angegeben Tukey’s HSD Test aus dem R-Paket ‚agricolae‘ verwendet. Hauptkomponentenanalysen wurden mit der Funktion prcomp aus dem R-paket ‚stats‘ durchgeführt, dazu wurden die die Daten dazu jeweils durch Subtraktion des Mittels zentriert und durch Division mit der Stan-dardabweichung skaliert (R Core Team 2013).
𝑥𝑖𝑗 = µ + 𝑔𝑖+ 𝑢𝑗+ 𝑔𝑢𝑖𝑗+ 𝑒𝑖𝑗 mit 𝑥𝑖𝑗 Beobachtungswert des i-ten Genotyps in der j-ten Umwelt
µ Versuchsmittel
𝑔𝑖 Effekt des i-ten Genotyps 𝑢𝑗 Effekt der j-ten Umwelt
𝑔𝑢𝑖𝑗 Interaktionseffekt zwischen i-tem Genotyp und j-ter Umwelt 𝑒𝑖𝑗 Restfehler
2 Material und Methoden 24
2.2 Kartierungsexperiment Glucosinolatvererbung