GFP F USIONSKONSTRUKTE

Ein ähnliches Bild zeigt sich unter der Verwendung des RNAi Konstruktes gegen HvDRF1. Während in Steptoe der relative DsRED/GFP Wert unter Stressbedingungen nahezu identisch mit der Kontrolle ist sinkt er in Golden Promise um ca. 35% (65 ± 4,31%, Abbildung 18).

In Morex konnte mit diesem Konstrukt ebenfalls ein signifikantes Ergebnis erzielt werden. Im Vergleich zur Kontrolle lag der relative DsRED/GFP Wert hier 20% niedriger. Dieses Resultat wurde jedoch erst erhalten, nachdem basierend auf einem Ausreißertest (Nalimow), das Ergebnis aus dem fünften Experiment eliminiert worden war.

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GFP::Gen::GFP Kassette bildete folglich einen durchgehenden Leserahmen, dessen Expression ein doppeltes GFP-Fusionsprotein erzeugte.

Die Untersuchung der mit diesem Fusionskonstrukt transformierten Zellen ergab, dass diese eine schwache Fluoreszenz, die sich deutlich vom Wildtyp abgrenzen lies, aufwiesen (Abbildung 19, Bilder E, F). Obwohl es sich bei dem

Abbildung 19: Detektion der GFP Fluoreszenzsignale in den Zellen der Blattepidermis.

Die Darstellung zeigt fluoreszierende Zellen, welche entweder mit pGFP (A, B) oder mit den Fusionskonstrukten HvDREB1::GFP (C, D) bzw. GFP::HvDRF1::GFP (E, F) transformiert worden sind. Die Auswertung erfolgte 24 h nach dem Beschuss der Gerstenblätter (Golden Promise). Die Bilder A, C und E stellen typische Zellen in einer höheren Vergrößerung dar. Der Größenmaßstab beträgt 20 µm und ist in jedem Bild durch eine horizontale weiße Linie gekennzeichnet.

Gen HvDRF1 um einen Transkriptionsfaktor handelt (Xue et al., 2004), konnte das Fusionsprotein in der gesamten Zelle detektiert werden und war weder auf den Zellkern noch auf die Mitochondrien beschränkt. Das Ergebnis stand somit im Gegensatz zum erwarteten Phänotyp, der dem des HvDREB1::GFP Fusionsproteins ähneln müsste.

3.5.1 Test auf Cross-Silencing Effekte

Nachdem die Fusionskonstrukte, hinsichtlich ihrer Fluoreszenz, erfolgreich getestet worden waren, konnten mit ihnen die Silencing Experimente durchgeführt werden. Dazu wurde der detached leaf assay in einer leicht abgeänderten Form verwendet (siehe auch 2.11). Zum Beispiel wurden in jedem Ansatz jeweils der Vektor für das DsRED Reporterprotein, der Vektor für ein GFP-Fusionsprotein (HvDREB1::GFP bzw. GFP::HvDRF1::GFP), sowie ein RNAi Konstrukt (HvDRF1, HvDREB1 oder die Kontrolle pIPKTA30) gemischt und in die Zellen der Blattepidermis co-transformiert. Die Primärblattsegmente wurden nach der Auswertung der GFP Fluoreszenz auch nicht wie sonst üblich dem Stress durch Dehydration ausgesetzt, da die Auswertung der DsRED Zellen für die Normalisierung des Experiments benötigt wurde, sondern für 4 Tage auf Phytoagar belassen.

Nach Auswertung der DsRED Zellen wurden die entsprechenden GFP Zellen auf diese normalisiert und das Verhältnis zwischen den RNAi Konstrukten und der Kontrolle (pIPKTA30) verglichen. Um ein besseres statistisch signifikantes Ergebnis erhalten zu können wurden die Experimente blattweise ausgewertet und analysiert. Wie aus der Abbildung 20 hervorgeht, werden weniger GFP Zellen detektiert, wenn das entsprechende gegen die Zielsequenz gerichtete RNAi Konstrukt verwendet wird. Damit wird klar, dass beide Konstrukte gegen ihre Zielsequenz wirken, obwohl das RNAi Konstrukt gegen HvDREB1 im RNAi Screen für Trockenstresstoleranz keinen Effekt gezeigt hatte (siehe Abbildung 10). Wie aus den Experimenten ebenfalls hervorgeht, kann zwischen einzelnen Familienmitgliedern exakt unterschieden werden und ein cross-silencing findet zumindest im Falle dieser beiden untersuchten Konstrukte nicht statt.

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0 20 40 60 80 100 120 140 160

HvDREB1 RNAi HvDRF1 RNAi HvDRF1 RNAi HvDREB1 RNAi

HvDREB1::GFP GFP::HvDRF1::GFP

Relatives GFP/DsRED Verhältnis in %

Abbildung 20: Einfluss der RNAi Konstrukte HvDRF1 und HvDREB1 auf das GFP/DsRED Verhältnis.

Im Diagramm sind die Mittelwerte für beide RNAi Konstrukte in Relation zum Mittelwert des leeren RNAi-Vektors pIPKTA30 (Kontrolle, auf 100% gesetzt) dargestellt. Für den Beweis der Spezifität der RNAi Konstrukte wurden zwei verschiedene GFP-Fusionskonstrukte eingesetzt (siehe Text). Die Streuungsbalken geben den Fehler der Standardabweichung wieder.

3.5.2 Weitere Überprüfung der Target-Spezifität

Um sogenannte off-target Effekte zusätzlich ausschließen zu können wurden zwei weitere RNAi Konstrukte generiert, welche gegen andere Bereiche der mRNA von HvDRF1, einem der Zielgene gerichtet waren (siehe Abbildung 22).

Dabei wird deutlich, dass alle drei gegen HvDRF1 gerichteten RNAi Konstrukte die Anzahl an grün fluoreszierenden Zellen, die GFP::HvDRF1::GFP co-exprimierten, signifikant senken konnten (Tabelle 16).

Tabelle 16: Zielgerichtetes Silencing des GFP::HvDRF1::GFP Fusionskonstruktes.

In der Übersicht sind die relativen GFP Zellzahlen nach Verwendung unterschiedlicher RNAi Konstrukte zusammengestellt. Die Auswertung der GFP Expression erfolgte 24 h nach dem Beschuss. Im Gegensatz dazu wurde DsRED 5 Tage nach Beschuss detektiert um anschließend eine Normalisierung der GFP Zellzahl auf pUbi-DsRED-Nos durchzuführen. Es wurden insgesamt vier Experimente in Golden Promise für eine Analyse durchgeführt und blattweise ausgewertet.

(a) Relativ zum leeren RNAi Vektor pIPKTA30 (Kontrolle) ^(b)Anzahl ausgewerteter Blattsegmente

GFP-Expression in % ^(a)

Fehler der Standard-abweichung

p-Wert

(p n ^(b)

HvDRF1_RNAi1 59,96 5,84 1,5341E-06 20

HvDRF1_RNAi2 67,59 4,53 8,5072E-07 20

HvDRF1_RNAi3 71,82 4,11 1,5043E-06 20

HvDREB1_RNAi 105,27 9,82 0,59738545 20

Das HvDREB1 Konstrukt hatte erwartungsgemäß keinen Einfluss auf die Anzahl an fluoreszierenden Zellen und lag auf gleichem Niveau mit der Kontrolle (pIPKTA30, entspricht 100 %).

3.5.3 Effektivität der RNAi Konstrukte gegen HvDRF1

Betrachtet man alle drei gegen HvDRF1 gerichteten RNAi Konstrukte, im

« normalen » Screening, d.h. deren Auswirkung auf das DsRED/GFP Verhältnis unter Trockenstressbedingungen und vergleicht dies mit der leeren Vektorkontrolle pIPKTA30, dann werden nur minimale Unterschiede in der Effizienz zwischen ihnen sichtbar.

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RNAi1 RNAi2 RNAi3 RNAi

HvDRF1 HvDREB1

Relatives DsRED/GFP Verhältnis in %

Abbildung 21: Signifikante Verminderung des relativen DsRED/GFP Verhältnisses durch RNAi Konstrukte, welche gegen unterschiedliche Regionen von HvDRF1 gerichtet sind.

Im Diagramm sind die Mittelwerte für drei RNAi Konstrukte in Relation zum Mittelwert des leeren RNAi-Vektors pIPKTA30 (Kontrolle, auf 100% gesetzt) dargestellt. Das Konstrukt gegen HvDREB1, ebenfalls ein DREB2-like Gen, zeigte nur einen Effekt gegen das DREB1::GFP Fusionskonstrukt (siehe 3.5.1), hatte jedoch keine Auswirkungen auf das relative DsRED/GFP Verhältnis unter Stressbedingungen im RNAi Screen. Die Streuungsbalken geben den Fehler der Standardabweichung wieder.

Die Resultate für das erste und zweite RNAi Konstrukt, welche einen Bereich abdecken, der die charakteristische AP2 Bindedomäne beinhaltet, sind nahezu identisch. Das dritte Konstrukt, welches gegen das 3´ Ende der mRNA gerichtet ist, kann das DsRED/GFP Verhältnis zwar um 2 % stärker senken (Abbildungen 21 und 22), dies dürfte jedoch innerhalb der Fehlertoleranz liegen.

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Alle drei RNAi Konstrukte erniedrigten das Verhältnis von DsRED- zu GFP fluoreszierenden Zellen signifikant (Abbildung 22).

Das gegen HvDREB1 gerichtete, als Negativkontrolle verwendete, RNAi Konstrukt zeigte hingegen keinen Effekt.

Abbildung 22: Zielregionen der drei gegen HvDRF1 gerichteten RNAi Konstrukte.

Die Zielregionen der drei gegen die mRNA von HvDRF1 gerichteten RNAi Konstrukte sind durch schwarze horizontale Linien gekennzeichnet. Darunter befinden sich die erreichten relativen DsRED/GFP Werte im Vergleich zur Kontrolle [diese entspricht dem Wert 1 (bzw. 100%)]. In Klammern werden die Ergebnisse des gepaarten two-sample t-test (es wurde zweiseitig getestet) wiedergegeben. [Darstellung wurde entnommen aus Marzin et al., Journal of Experimental Botany 59(12): 3359-3369 (2008)]

3.6 Ermittlung der Transkriptmenge von HvDRF1, HvDHN6, HvHVA1 und