3. ERGEBNISSE
3.6 E RMITTLUNG DER T RANSKRIPTMENGE VON H V DRF1, H V DHN6, H V HVA1
ERGEBNISSE 96
Alle drei RNAi Konstrukte erniedrigten das Verhältnis von DsRED- zu GFP fluoreszierenden Zellen signifikant (Abbildung 22).
Das gegen HvDREB1 gerichtete, als Negativkontrolle verwendete, RNAi Konstrukt zeigte hingegen keinen Effekt.
Abbildung 22: Zielregionen der drei gegen HvDRF1 gerichteten RNAi Konstrukte.
Die Zielregionen der drei gegen die mRNA von HvDRF1 gerichteten RNAi Konstrukte sind durch schwarze horizontale Linien gekennzeichnet. Darunter befinden sich die erreichten relativen DsRED/GFP Werte im Vergleich zur Kontrolle [diese entspricht dem Wert 1 (bzw. 100%)]. In Klammern werden die Ergebnisse des gepaarten two-sample t-test (es wurde zweiseitig getestet) wiedergegeben. [Darstellung wurde entnommen aus Marzin et al., Journal of Experimental Botany 59(12): 3359-3369 (2008)]
3.6 Ermittlung der Transkriptmenge von HvDRF1, HvDHN6, HvHVA1 und
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
-0,1 0,4 0,9 1,4 1,9 2,4 2,9
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
-0,3 1,7 3,7 5,7 7,7 9,7
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
3 2,5
2 1,5
1 0,5
0
10 8 6 4 2 0
HvDRF1
HvNHX1
HvDhn6
HvHVA1
Relative Transkriptmenge
S tressdauer (h)
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
-0,1 0,4 0,9 1,4 1,9 2,4 2,9
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
-0,3 1,7 3,7 5,7 7,7 9,7
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
3 2,5
2 1,5
1 0,5
0
10 8 6 4 2 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
-0,1 0,4 0,9 1,4 1,9 2,4 2,9
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
-0,3 1,7 3,7 5,7 7,7 9,7
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
3 2,5
2 1,5
1 0,5
0
10 8 6 4 2 0
HvDRF1
HvNHX1
HvDhn6
HvHVA1
Relative Transkriptmenge
S tressdauer (h)
Abbildung 23: Real-time PCR Ergebnisse zur Expression von HvDRF1, HvDHN6, HvHVA1 und HvNHX1 in transformierten und nicht-transformierten Proben.
Die Ergebnisse wurden für die Zeitpunkte 1 h, 6 h, 24 h, 48 h sowie 96 h nach Stressbeginn für alle Kandidaten ermittelt und auf die Transkriptmenge des Gens UBC normalisiert (siehe 2.10.2.3). Die Datenpunkte setzen sich aus zwei technischen Wiederholungen der qRT-PCR zusammen. Die Streuungsbalken geben die Minimum- und Maximumwerte wieder. Die Ergebnisse der Kontrollen werden durch ausgefüllte Symbole dargestellt und die Ergebnisse der gestressten Proben durch leere Symbole.
Die Experimente wurden mit Golden Promise durchgeführt.
Die Transkriptmenge der vier getesteten Gene wurde durch die Software von Applied Biosystems (siehe 2.15) mittels einer zuvor erstellten Standardkurve berechnet und auf die Transkriptmenge des UBC Gens aus Gerste (siehe 2.10.2.3) normalisiert. Die daraus resultierenden Ergebnisse zeigen je nach
Kontrolle nicht beschossen
Kontrolle beschossen
Stress nicht beschossen
Stress beschossen
ERGEBNISSE 98
untersuchtem Transkript ein unterschiedliches Expressionsmuster (siehe Abbildung 23).
Das LEA Transkript HvHVA1 wurde bereits 1 h nach Beginn des Stresses induziert und erreichte nach 6 h das Abundanz-Maximum. Nach 24 h war die Menge wieder auf dem Niveau der Kontrolle angelangt und verblieb dort bis zum Ende des Experiments.
Dehydrin 6 wurde ebenfalls 1 h nach Stressbeginn stark hochreguliert.
Wahrscheinlich passierte dies aber schon früher, da die Transkriptmenge bereits zu diesem Zeitpunkt das Maximum erreichte. Die Expression von HvDHN6 war, ähnlich wie die von HvHVA1, nur transient.
Das Transkript für den Na+/H+ Antiporter HvNHX1 war bereits zum Anfang der Stressperiode induziert, und diese Induktion wurde während der gesamten Laufzeit von 4 Tagen noch weiter verstärkt. In den Proben der Kontrolle war ebenfalls eine geringe Induktion zu erkennen, jedoch bleibt der Transkriptlevel annähernd gleich hoch bis zum Ende.
Auch das Transkript des Transkriptionsfaktors HvDRF1 war, ähnlich wie HvNHX1, bereits von Anfang an in niedriger Konzentration vorhanden und wurde während der Stressphase noch weiter verstärkt.
Um die Replizierbarkeit der erzeugten Daten zu beweisen wurde ein zweites biologisches Experiment durchgeführt und in Analogie zum ersten Experiment RNA isoliert. Da die bedeutendsten Unterschiede während der ersten drei Zeitpunkte (1 h, 6 h, 24 h) im ersten Experiment zu beobachten waren, wurden in der Wiederholung nur noch diese betrachtet (Abbildung 24). Auch zwischen beschossenem und nicht-beschossenem Material zeigten sich im ersten Experiment keine Unterschiede, so dass dies in der Wiederholung ebenfalls nicht erneut betrachtet wurde.
Der Vergleich beider biologischer Experimente lässt größtenteils praktisch keine Unterschiede erkennen. Für alle drei untersuchten Zeitpunkte gibt es nur wenige Abweichungen. Unterschiede lassen sich nur in der Transkriptmenge für HvNHX1 und HvDRF1 unter Stressbedingungen beobachten.
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
1h 6h 24h
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
Kontrolle Stress
HvDRF1
HvNHX1
HvDhn6
Relative Transkriptmenge
HvHVA1
Experiment 1 Experiment 2 Experiment 1 Experiment 2
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
1h 6h 24h
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
Kontrolle Stress
HvDRF1
HvNHX1
HvDhn6
Relative Transkriptmenge
HvHVA1
Experiment 1 Experiment 2 Experiment 1 Experiment 2
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
1h 6h 24h
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
Kontrolle Stress
HvDRF1
HvNHX1
HvDhn6
Relative Transkriptmenge
HvHVA1
Experiment 1 Experiment 2 Experiment 1 Experiment 2 0
0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
Kontrolle Stress
HvDRF1
HvNHX1
HvDhn6
Relative Transkriptmenge
HvHVA1 0
0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Real time 1 Real time 2 Real time 1 Real time 2
CT DS
Kontrolle Stress
HvDRF1
HvNHX1
HvDhn6
Relative Transkriptmenge
HvHVA1
Experiment 1 Experiment 2 Experiment 1 Experiment 2
Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass alle vier untersuchten Gene unter den gegebenen Experimentbedingungen des RNAi Screens für Trockentoleranz normal induzierbar sind und der beobachtete Effekt nicht auf die biolistische Transformation zurückzuführen ist.
Abbildung 24: Vergleich der Real-time PCR Ergebnisse von HvDRF1, HvDHN6, HvHVA1 und HvNHX1 unter Stressbedingungen, aus zwei unabhängigen Experimenten.
Die Ergebnisse wurden für die Zeitpunkte 1 h, 6 h und 24 h nach Stressbeginn für alle Kandidaten ermittelt und auf die Transkriptmenge des Gens UBC normalisiert (siehe 2.10.2.3). Die Datenpunkte setzen sich aus jeweils zwei Experimenten zusammen. Die Streuungsbalken geben die Minimum- und Maximumwerte wieder. Die Abbildung zeigt die Ergebnisse mit transformierten (pIPKTA30, pUBI-DsRED-Nos, pGFP) Pflanzenmaterial.
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