Gewinnung monoklonaler Antikörper

Die Arbeiten für die Gewinnung monoklonaler Antikörper wurden nach Harlow, Howard und Lindl durchgeführt (Harlow, 1988; Howard, 2001; Lindl, 2002).

2.2.9.10.1. Immunisierung von Mäusen

Als Antigene für die Gewinnung monoklonaler Antikörper gegen das E2-Glykoprotein von Pestiviren wurde gereinigtes rE2 (Isolate CP7, 890 und Gi-1) verwendet. Jeweils 2-3 weibliche, 6 Wochen alte Balb/c-Mäuse wurden mit je 3 µg Protein je Immunisierung inokuliert. Als Adjuvans wurde komplettes Freundsches Adjuvans (erste Immunisierung) bzw. inkomplettes Freundsches Adjuvans (folgende Immunisierungen) benutzt. Mäuse wurden nach dem u.a. Schema (Abb. 3) immunisiert.

2.2.9.10.2. Gewinnung, Konservierung und Ausplattierung von Feeder-Zellen

Das klonale Wachstum einzelner frisch fusionierter Hybridome ist meist unzureichend. Die Hybridome benötigen u.a. Wachstumsfaktoren wie IL-6 sowie Spurenelemente wie Selen und sind empfindlich gegenüber Zelltoxinen. Verbessert werden kann das Wachstum durch den Einsatz von "Feeder" Zellen, z.B. Thymozyten, Fibroblasten oder Makrophagen, die mit den fusionierten Zellen kokultiviert werden. Alternativ können filtrierte Überstände von Feeder Kulturen zur Stimulierung des Hybridomwachtums verwendet werden (Howard, 2001).

Ein bis zwei Wochen vor der Fusion wurden Peritoneal-Exsudat-Zellen von Balb/c Mäusen als Feeder-Zellen gewonnen. Die Euthanasie der Mäuse erfolgte nach der Betäubung mit Äther durch cervikale Dislokation. Die Mäuse wurden in 70% Ethanol getaucht und auf Styropor fixiert. Nach der Desinfektion wurde die Haut vom Xyphoid bis zur Inguinalregion gespalten und die abdominale Muskelschicht frei präpariert ohne die Bauchhöhle zu eröffnen. 5 ml Hepes-Medium wurden unter das Peritoneum gespritzt. Der

Bauch wurde leicht massiert und die Flüssigkeit mit der Spitze abgesaugt. Dieser Vorgang wurde mehrfach wiederholt.

Gewonnene Zellen wurden gezählt und in Aliquots von 1 x 10⁷ Zellen/ml eingefroren. Um die Sterilität der Präparationen zu testen wurden 2 x 10⁶ Zellen ausplattiert und für 10 Tage kultiviert.

Einen Tag vor der Fusion wurde jeweils 1 Aliquot Feeder Zellen auf 5 96well Platten (in 100 µl Fusions-Medium/Vertiefung) ausplattiert.

Abb. 3: Schematische Darstellung der Immunisierung von Mäusen für die Gewinnung monoklonaler Antikörper. Weibliche 6 Wochen alte Balb/c Mäuse wurden an den Tagen 0, 15, 30 und 45 subkutan (s.c.) mit rE2 (3µg pro Applikation in 50µl PBS und 50µl Freund´schem Adjuvans) von zwei BVDV-Stämmen immunisiert. 15 Tage nach der letzten Immunisierung wurde Blut entnommen und Serum gewonnen, das mittels Immunfluoreszenz auf Antikörpern gegen E2 getestet wurde. Mäuse mit hohem Antikörper-Titer wurden dreimal im Abstand von je 24 Stunden intraperitoneal (i.p.) mit rE2 (3µg in 100 µl PBS) immunisiert. 3 bis 5 Tage nach der letzten Immunisierung wurden Milzzellen für die Fusion gewonnen.

Maus Antigen Adjuvans

Balb/c rE2/CP7 Freund´sches Adjuvans WWeeiibblliicchh rrEE22//889900

6 Wochen alt 3 µg/Immunisierung

0 15 30 45 60 61 62 63 68

Tage

IP

SC

FuFussiioonn SSccrreeeenniinngg

0.1 0.5 1.0 1.5

SC SC SC IP IP

2.2.9.10.3. Gewinnung der Splenozyten (Milzzellen)

Die Tötung der Mäuse erfolgte durch cervikale Dislokation nach Betäubung mit Äther. Zur Entnahme der Milz wurden die Mäuse auf dem Rücken fixiert, nach Desinfektion mit 70%

Ethanol die Haut vom Xyphoid bis zur Inguinalregion durchtrennt und die Bauchmuskulatur freipräpariert. Nach Eröffnung der Bauchhöhle wurde die Milz steril entnommen und in eine Petrischale mit 10 ml Hepes-Medium gegeben. Das noch anhaftende Bindegewebe wurde entfernt und die Milzkapsel an einem Pol eröffnet. Die Milzpulpa wurde vorsichtig durch die vorgenannte Öffnung herausgespült. Hierzu wurde die Kanüle einer mit Hepes-Medium gefüllten 10 ml Spritze am entgegengesetzten Pol der Milz durch die Kapsel gestochen und bei geringem Druck gespült. Der Vorgang wurde bis zu einer deutlichen Entfärbung der Milz wiederholt. Die gewonne Zellsuspension wurde in ein 50 ml Falcon-Röhrchen überführt. Nach kurzer Zeit sedimentierten die größeren Gewebestücke und der ÜS wurde in eines neues 50 ml Falcon-Röhrchen pipettiert. Die Splenozyten wurden bei 3,000 rpm für 5 Min. zentrifugiert und zweimal mit Hepes-Medium gewaschen.

Zur Bestimmung der Zellzahl wurde ein Aliquot 1:10 mit Türk´s-Färbelösung versetzt und in einer Zählkammer nach Neubauer (Fa. Assistent) unter einem Umkehrmikroskop ausgezählt.

2.2.9.10.4. Fusion von Splenozyten und Myelomzellen

Zur Fusion wurde die Myelomzelllinie SP 2/0 verwendet. Diese wurden im Verhältnis 1:1 (1x10⁷ Myelomzellen: 1x10⁷ Splenozyten) zu den Splenozyten gegeben. Die Zellen wurden bei 3,000 rpm für 4Min.pelletiert und der Überstand entfernt. Anschließend wurde dem Pellet über einen Zeitraum von einer Minute unter leichtem Schwenken in einem 37°C Wasserbad 1ml PEG 1500 Lösung zugegeben. Danach erfolgte zur Verdünnung des PEG die Zugabe von 1 ml Hepes-Medium nach 60 Sek., 3 ml Hepes-Medium nach 90 Sek. und 10 ml Hepes-Medium nach 2 Min. Die fusionierten Zellen wurden bei 300 g für 5 Min pelletiert, in 100-150 ml Hybridom-Medium resuspendiert und auf 10-15 Mikrotiterplatten mit Feeder Zellen (100 µl/Vertiefung) verteilt. Die Platten wurden 1 bis 2 Tage im Brutschrank inkubiert.

2.2.9.10.5. Selektion von Hybridomzellen

Die bekannteste Methode für die Selektion von Hybridomzellen ist die Verwendung von Myelomzelllinien, denen das Enzym Hypoxanthin Guanin Phosphoribosyl Transferase (HGPRT) fehlt. Bei Kultivierung dieser Zellen in HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) blockiert Aminopterin die Biosynthese von Nukleotiden. Hybridomzellen produzieren HGPRT und können, wenn das Medium mit Hypoxanthin und Thymidin supplementiert ist, auf einem alternativen Weg Nukleotide synthetisieren (Harlow, 1988;

Howard, 2001).

Zur Selektion wurde das Medium der ausplattierten Zellfusionen nach 1 oder 2 Tagen Inkubation auf HAT-Medium (s.o.) umgestellt. Im Abstand von 2 bis 3 Tagen wurden Platten sowohl makroskopisch als auch mikroskopisch auf das Wachstum von Zellkolonien kontrolliert, um den geeigneten Zeitpunkt für die Untersuchung der gewachsenen Hybridzellkolonien auf die Produktion von Antikörpern zu ermitteln. Nach ca. 9 Tagen Selektion wurde von HAT-Medium auf HT-Medium umgestellt und das erste Screening durchgeführt.

2.2.9.10.6. Screening von Hybridomzellen

Das erste Screening fand statt, nachdem die Klone etwa 30% des Bodens der Vertiefungen bedeckten, was nach etwa 10-14 Tagen der Fall war. Dazu wurden 200 µl Medium aus jeder Vertiefung abgenommen und durch frisches Medium ersetzt. Das abgenommene Medium wurde mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz auf die Produktion virusspezifischer Antikörper untersucht. Hierfür wurden mit den BVDV Stämmen CP7, 890 und Gi-1 infizierte MDBK-Zellen verwendet. Die Platten wurden 72 Stunden nach der Infektion zweimal mit PBS gewaschen und mit Aceton-Methanol 1:1 für 20 Min. bei 4°C fixiert. Das Fixans wurde nach der Inkubation verworfen und der Zellrasen luftgetrocknet.

Die fertigen Platten wurden bei RT oder 4°C bis zur Gebrauch aufbewahrt. Als Kontrollen wurden Platten mit nicht infizierten MDBK Zellen in gleicher Weise präpariert. Für das Screening wurden die Testplatten mit PBS rehydriert und mit 50 µl Hybridomüberstand je Vertiefung überschichtet. Nach einer Inkubation von 60 Min. wurden die Platten gewaschen und mit einem Ziege anti-Maus Cy3 Konjugat (s.o.) überschichtet (50 µl/Vertiefung). Die Auswertung erfolgte, nach abermaligem Waschen, unter einem

inversen Fluoreszenzmikroskop (s.o.). Zellklone (Mutterklone), die im IF-Test eine virusspezifische positive Reaktion zeigten, wurden auf neue Mikrotiterplatten (96well) umgesetzt.

2.2.9.10.7. Klonierung positiver Hybridome

Um die Monoklonalität der Zellkolonien zu gewährleisten wurden diese mehrfach rekloniert. Zuvor wurde zur Sicherung der Zellen mindestens eine Portion eingefroren. Für die Reklonierung wurde die "limited-dilution"-Methode angewandt. 96well-Platten wurden mit 100 µl Hybridom-Medium je Vertiefung (s. o.) beschickt. Zellen aus den als positiv identifizierten Vertiefungen (Mutterklone, s.o.) wurden vorsichtig resuspendiert, 50 µl der Zellsuspension in die erste Vertiefung A1 überführt. Ausgehend von der ersten Vertiefung wurde eine 1:3 Verdünnungsreihe in den Vertiefungen A1 bis H1 hergestellt. Danach wurden je 100 µl Hybridom-Medium in die vorgenannten Vertiefungen zugegeben.

Ausgehend von der ersten Reihe wurde eine 1:2 Verdünnungsreihe über zwölf Reihen mit einer Mehrkanalpipette hergestellt. Abschließend wurden weitere 100 µl Hybridom-Medium in jede Vertiefung pipettiert. Die Inkubation erfolgte für 10 bis 14 Tage im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2.

Zur Identifikation positiver Klone wurde die Immunfluoreszenz analog zum ersten Screening verwendet (s.o.). Sobald sich die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase befanden, wurden sie erneut rekloniert. Dieses Verfahren wurde insgesamt 3-4mal wiederholt. Abschließend wurden von jedem Hybridzellklon Aliquots von ca. 10⁶Zellen/ml eingefroren.

2.2.9.10.8. Produktion von mAk

Klone, die stabil E2 spezifische mAk produzierten wurden auf Kulturschalen mit 25cm Durchmesser expandiert. Der Kulturüberstand von den Hybridomen wurde abgenommen, bei 3200 rpm geklärt und der zellfreie Überstand bei –20°C eingefroren.

2.2.9.11. Charakterisierung der monoklonalen Antikörper