Gesteigerte zelluläre Cathepsin-B-Expression in Zellen der CBG- und MCBG-Klone

Zur direkten Untersuchung der Cathepsin-B-Expression wurde die Bindung eines Antikörpers gegen Cathepsin B in fixierten und permeabilisierten Zellen bestimmt. Der eingesetzte Antikörper reagierte sowohl mit endogenem Cathepsin B als auch mit den Fusionsproteinen CBG und MCBG. Durchflusszytometrisch wurde die mittlere Fluoreszenzintensität eines Tri-Color^®-markierten Sekundärantikörpers gemessen. Bei jeder Messung wurden außerdem die Autofluoreszenz und die Fluoreszenz nur mit Sekundärantikörper behandelter Zellen erfasst. Die Differenz der mittleren Fluoreszenzintensitäten mit und ohne Primärantikörper wurde als spezifische mittlere Fluoreszenzintensität (sMFI) berechnet.

Die durchflusszytometrische Bestimmung der Cathepsin-B-Expression wurde mit Zellen beider LV-Klone, beider CBG-Klone und auch beider MCBG-Klone durchgeführt. In den Zellen der LV-Klone war endogenes Cathepsin B nachweisbar. Die im Vergleich zu den Zellen der LV-Klone verstärkte Antikörperbindung in Zellen der Klone CBG-2 und CBG-5 sowie in Zellen der Klone MCBG-2 und MCBG-4 zeigte eine Steigerung der Cathepsin-B-Menge in den Zellen der CBG- und MCBG-Klone. Es wurden drei unabhängige Messungen durchgeführt. Abb. 15 zeigt eine beispielhafte Messung und die Gesamtauswertung aller Messungen.

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Abb. 15: Durchflusszytometrische Analyse der Cathepsin-B-Expression an permeabilisierten Zellen Im Histogramm sind die Zellen nach ihrer Fluoreszenzintensität sortiert aufgetragen. Violett gefüllt ist die Eigenfluoreszenz der Zellen ohne Antikörper dargestellt, Rot zeigt die Fluoreszenz der Sekundärantikörperkontrollen und Grün die Fluoreszenz mit Primär- und Sekundärantikörper. Der Unterschied zwischen roter und grüner Kurve gibt die Bindung des Primärantikörpers in den Zellen an.

A und B Die mit Primärantikörper behandelten Zellen der Klone LV-2 und LV-5 wiesen eine höhere Fluoreszenzintensität als die Sekundärantikörperkontrollen auf.

C und D Die Messung von Zellen der Klone CBG-3 und CBG-5 zeigte ebenfalls eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität der Zellen der Primärantikörperfärbungen gegenüber den Sekundärantikörperkontrollen.

E und F Auch bei Zellen der Klone MCBG-2 und MCBG-4 wurde die Bindung des Antikörpers gegen Cathepsin B im Vergleich von Primärantikörperfärbung und Sekundärantikörperkontrolle gezeigt.

G Die spezifischen mittleren Fluoreszenzintensitäten (sMFI) von Zellen der LV-Klone (grau), der CBG-Klone (rot) und der MCBG-Klone (blau) sind als Mittelwerte mit Standardabweichungen aus drei unabhängigen Messungen angegeben.

61 3.3.5 Geringgradig gesteigerte oberflächengebundene Cathepsin-B-Expression von

Zellen der CBG- und MCBG-Klone

Neben dem Einfluss einer veränderten Cathepsin-B-Gesamtmenge sollte auch der Einfluss von zellmembrangebundenem Cathepsin B auf die Lyse durch zytotoxische T-Zellen bestimmt werden. Besonders die MCBG-Klone dienten dem Ziel der Expression von Cathepsin B auf der Zelloberfläche, aber auch die Oberflächenexpression von Cathepsin B an den Zellen der CBG-Klone wurde untersucht.

Extrazellulär gebundenes Cathepsin B wurde durch Immunfärbung nicht permeabilisierter Zellen nachgewiesen. Der eingesetzte Antikörper reagierte sowohl mit dem endogenen Cathepsin B als auch mit den Cathepsin-B-Anteilen der CBG- und MCBG-Fusionsproteine.

Als Vergleich dienten die Messungen des extrazellulären Cathepsin B auf der Oberfläche von Zellen der LV-Klone.

Unspezifische Bindungen des fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpers führten zu starker Fluoreszenz der Sekundärantikörperkontrollen und erschwerten die Messungen. Auf der Oberfläche der Zellen der LV-Klone war keine Bindung des anti-Cathepsin-B-Antikörpers nachweisbar, eine oberflächenassoziierte Cathepsin-B-Expression konnte bei den Zellen der LV-Klone durchflusszytometrisch nicht gezeigt werden. Die Zellen der CBG- und MCBG-Klone wiesen hingegen eine schwache spezifische Fluoreszenz auf, sodass hier eine geringe oberflächenassoziierte Cathepsin-B-Expression dargestellt werden konnte. Die Zellen der MCBG-Klone zeigten dabei keine stärkere membrangebundene Cathepsin-B-Expression als die Zellen der CBG-Klone. Abb. 16 zeigt das Beispiel einer Messung und die Gesamtauswertung der spezifischen Fluoreszenzen.

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Abb. 16: Durchflusszytometrische Analyse der Cathepsin-B-Oberflächenexpression

Im Histogramm sind die Zellen nach ihrer Fluoreszenzintensität sortiert aufgetragen. Violett gefüllt ist die Eigenfluoreszenz der Zellen ohne Antikörper dargestellt, Rot zeigt die Fluoreszenz der Sekundärantikörperkontrollen und Grün die Fluoreszenz mit Primär- und Sekundärantikörper. Der Unterschied zwischen roter und grüner Kurve gibt die Bindung des Primärantikörpers auf der Oberfläche der Zellen an.

A und B Bei den Zellen der Klone LV-2 und LV-5 bestanden keine Unterschiede der Fluoreszenzintensitäten der Primärantikörperfärbungen und der Sekundärantikörperkontrollen.

C und D Die Messung mit Zellen der Klone CBG-3 und CBG-5 zeigte eine geringe Erhöhung der Fluoreszenzintensitäten der Zellen der Primärantikörperfärbungen gegenüber denen der Sekundärantikörperkontrollen. Allerdings war die Fluoreszenz der Sekundärantikörperkontrollen sehr stark.

E und F Auch bei Zellen der Klone MCBG-2 und MCBG-4 waren die Fluoreszenzen der Primärantikörperfärbungen größer als die der Sekundärantikörperkontrollen. Diese waren allerdings auch hier wieder sehr stark.

G Angegeben sind Mittelwerte und Standardabweichungen der spezifischen mittleren Fluoreszenzintensitäten (sMFI) aus je drei unabhängigen Messungen von Zellen beider LV-Klone (grau), beider CBG-Klone (rot) und beider MCBG-Klone (blau).

63 3.3.6 Kein Nachweis einer oberflächengebundenen Expression des

MCBG-Fusionsproteins mit Hilfe des HA-Tags

Da die oberflächengebundene Cathepsin-B-Expression auf den Zellen der MCBG-Klone nachgewiesen werden konnte, diese aber nicht stärker war als die oberflächenassoziierte Cathepsin-B-Expression der Zellen der CBG-Klone, wurde nun direkt die oberflächengebundene Expression des MCBG-Fusionsproteins untersucht. Am N-terminalen extrazellulären Ende des Cathepsin-B-Anteils enthielt das MCBG-Fusionsprotein zu diesem Zweck die Aminosäuresequenz YPYDVPDYA des Hämagglutinins, die mit einem anti-HA-Tag-Antikörper spezifisch nachgewiesen werden sollte. Die Zellen der LV-Klone exprimierten keinen HA-Tag und dienten als Negativkontrollen.

Die Zellen beider MCBG-Klone zeigten wie die Zellen der LV-Klone keine Bindung des anti-HA-Tag-Antikörpers auf ihrer Oberfläche. Die oberflächengebundene Expression des MCBG-Fusionsproteins war mit Hilfe des HA-Tags in der Durchflusszytometrie nicht nachweisbar. In Abb. 17 ist eine exemplarische Messung und die Zusammenfassung aller Messungen dargestellt.

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Abb. 17: Durchflusszytometrische Analyse der oberflächengebundenen Expression des MCBG-Fusionsproteins mit Hilfe des HA-Tags

Im Histogramm sind die Zellen nach ihrer Fluoreszenzintensität sortiert aufgetragen. Violett gefüllt ist die Eigenfluoreszenz der Zellen ohne Antikörper dargestellt, Rot zeigt die Fluoreszenz der Sekundärantikörperkontrollen und Grün die Fluoreszenz mit Primär- und Sekundärantikörper. Der Unterschied zwischen roter und grüner Kurve gibt die Bindung des Primärantikörpers auf den Zellen an.

A und B Bei den Zellen der Klone LV-2 und LV-5 bestanden praktisch keine Unterschiede der Fluoreszenzintensitäten der mit Primärantikörper markierten Zellen und der Sekundärantikörperkontrollen.

C und D Auch bei den Zellen der MCBG-Klone zeigten sich keine Unterschiede zwischen Primär- und Sekundärantikörperkontrollen.

F Die spezifischen Fluoreszenzen waren sowohl bei den Zellen der LV-Klone (grau) als auch bei den Zellen der MCBG-Klone (rot) nur sehr gering. Die Grafik zeigt Mittelwerte und Standardabweichungen der spezifischen mittleren Fluoreszenzintensitäten (sMFI) aus drei unabhängigen Messungen.

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3.4 Immunoblots