Gentechnische Methoden

entsprechend verdünnt. Eine Nullprobe wurde vom LB-Medium vor dem Animpfen genommen und deren optische Dichte als Referenz verwendet. Die optische Dichte der Kultur wurde nach einer Stunde, nach zwei Stunden und dann im Abstand von 30 min bestimmt.

2.2.1.4. Plasmidpräparation aus E. coli XL1-Blue

Die Plasmidpräparation aus 5 mL XL1 Übernachtkulturen erfolgte mit dem Plasmidpräparationskit Nucle Spin Plasmid der Firma Macherey-Nagel nach den Angaben des Herstellers. Man bedient sich dabei dem Prinzip der alkalischen Lyse der Bakterienzellen mit anschließender selektiver Adsorption der Plasmide an einer Silika-Membran unter hohen Salzkonzentrationen. Lineare RNA und DNA wird vorher abgebaut. Die Elution der DNA erfolgte mit 50 µ L ddH20. Diese Methode lieferte Mengen von etwa 3 µg Plasmid-DNA.

2.2.1.5. Bestimmung der DNA-Konzentration

Die Konzentrationsbestimmung von aufgereinigter Plasmid- und Insert-DNA erfolgte bei Messung der Absorption bei 260 nm. Dabei entspricht eine Absorption von 1 etwa einer DNA-Konzentration von 50 µg/ml. Für eine grobe Abschätzung wurden die Proben auf ein Agarose-Gel aufgetragen und die DNA-Banden mit CybrSafe unter UV-Licht sichtbar gemacht. Anschließend wurde mit Referenz-Banden bekannter DNA-Menge verglichen.

2.2.1.6. Agarose-Gelelektrophorese

Je nach DNA-Menge wurden 5-20 µ L Probe mit jeweils 1-4 µ L 6 x Probenauftragspuffer für Agarose-Gele gemischt und auf ein 1 % (w/v) Agarosegel in 1 x TBE aufgetragen. Dem Gel wurde vor Erkalten 1:10000 (v/v) Cybr Safe hinzugegeben und gemischt. Die Elektrophorese erfolgte für ca. 45-90 min bei 100-150 Volt. Die DNA-Detektion erfolgte im Anschluss unter UV-Licht.

2.2.1.7. Polymerase-Kettenreaktion

Bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR; nach [206]) bedient man sich der in vitro-Amplifikation von geringen Mengen an DNA mittels spezifischer Primer und hitzetoleranter DNA-Polymerasen. Dabei wird die DNA-Menge in mehreren Zyklen exponentiell vervielfältigt. Für Klonierungszwecke wurde die Pfu DNA-Polymerase verwendet, da diese im Gegensatz zur Taq DNA-Polymerase eine Korrekturlesefunktion (3’5’

Exonukleaseaktivität) besitz. Für die Amplifikation der cDNA von P5a, -a' und -aa' aus pGEX-4T-2-P5 wurden folgende Reaktionsansätze gewählt:

Reagenz Konzentration im Ansatz

Forward-Primer^* 2 pM

Reverse-Primer^* 2 pM

Taq/Pfu Puffer mit MgSO4 1 x

dNTPs 0,2 mM

Taq/Pfu DNA-Polymerase 1 U

template-Vektor-DNA 10-25 ng

ddH2O ad 50 µ L

*s. Abschnitt 2.1.6.

Reaktionsbedingungen der PCR mittels thermocycler:

Reaktionsschritt Temperatur Zeit

P5a P5a' P5aa'

1. Initiale Denaturierung 94 °C 3 min

2. Denaturierung 94 °C 50 sec

3. Primer-Hybridisierung 55 °C 58 °C 58 °C 50 sec

4. Polymerisation 72 °C 50 sec (Taq); 100 sec (Pfu) Wiederholung Schritte 2. – 4. 29 x

5. Abschließende Polymerisation 72 °C 5 min

6. Reaktionsende 4 °C Ende

2.2.1.8. Aufreinigung von PCR-Produkten und geschnittener DNA

PCR-Produkte, geschnittene Vektoren und geschnittene Inserts wurden von Enzymen, Primern und dNTPs mittels Agarose-Gelelektrophorese getrennt. Die unter UV-Licht mittels Cybr Safe sichtbar gemachten DNA-Banden wurden mit einem sterilen Skalpell aus dem Agarose-Gel herausgechnitten. Die Extraktion aus dem Agarose-Gel erfolgte dabei nach Anleitung des Herstellers mit dem Nucleo Spin Extract II DNA Extraktions-Kit (Macherey-Nagel). Das Prinzip der Methode beruht, ähnlich wie bei der Plasmid-Präparation, auf der Adsorption der DNA an einer Silika-Membran. Die DNA wurde mit 30 µ L ddH2O eluiert.

2.2.1.9. Analytischer und präparativer Restriktionsverdau von PCR-Produkten und Plasmiden

Für die enzymatische Spaltung von PCR-Produkten und Ziel-Plasmiden wurden diese mit den jeweiligen Restriktionsenzymen in dem vom Hersteller empfohlenen Puffer inkubiert.

Gegebenfalls wurde BSA zugegeben. Der Restriktionsverdau erfolgte bei 37 °C im Thermoblock für 3 h. Das verdaute PCR-Produkt wurde im Anschluss mit dem Nucleo Spin Extract II DNA-Extraktions-Kit aufgereinigt. Der Restriktionsverdau wurde nach folgendem Schema angesetzt, wobei die Restriktionsenzyme stets zum Schluss zugegeben wurden:

Reagenz P5a; P5a'; P5aa' (pQE30) Restriktionsenzym I 10 U SphI

Restriktionsenzym II 10 U KpnI

BSA 1 x

Restriktions-Puffer 1 x NEB 1

DNA ~ 500 ng

ddH₂0 ad 10 µ L

2.2.1.10. Dephosphorylierung der geschnittenen Plasmide

10 µ L des verdauten Vektors wurden mit 1 µ L Alkalischer Phosphatase (1 U/µ L) und 1,2 µ L Dephosphorylierungspuffer (10 x) gemischt und 10 min bei 37 °C inkubiert.

Anschließend erfolgte die Hitzedenaturierung des Enzyms für 15 min bei 65 °C. Das verdaute Plasmid wurde danach mit dem Nucleo Spin Extract II DNA Extraktions-Kit aufgereinigt.

2.2.1.11. Ligation von DNA-Fragmenten

Die Ligation des geschnittenen und aufgereingten PCR-Produktes in das jeweilige Plasmid erfolgte in einem molaren Verhältnis von ca. 5:1. Dafür wurden 6 µ L des PCR-Produktes mit 2 µ L Plasmid-DNA und 1 µ L Ligasepuffer + ATP (10 x) gemischt. Dem Reaktionsansatz wurde 1 µ L T4 DNA-Ligase (1 U/µ L) hinzugefügt und mindestens 2 h bei 16 °C inkubiert. Der gesamte Ligations-Ansatz wurde anschließend in chemokompetente E.coli XL1-Blue Zellen transformiert.

2.2.1.12. Ethanol-Fällung von DNA

Für die Aufkonzentrierung und Abtrennung von DNA von Enzymen und freien Nukleotiden, wurde die Ethanol-Fällung angewandt. Mit dieser Methode wird unter sauren Bedingungen die DNA mit zunehmender Konzentration an Ethanol gefällt [207]. Dazu wurde die Probe auf ein Ausgangsvolumen von 50 µ L gebracht. Es wurden 5 µ L einer 3 M Natriumacetat-Lösung pH 5,2 zugegeben und gemischt. Anschließend wurde zur Probe 125 µ L eiskalter absoluter Ethanol zugegeben und gemischt. Nach Zentrifugation bei

16.000 g für 15 min bei 4 °C wurde der Überstand abgenommen und das DNA-Pelltet mit 500 µ L 70 % (v/v) Ethanol gewaschen. Es erfolgte erneut Zentrifugation bei 16.000 g für 10 min bei 4 °C. Der Überstand wurde komplett abgenommen und das DNA-Pellet bei RT unter dem Abzug getrocknet um Spuren von Ethanol zu beseitigen. Im Anschluss wurde die gefällte DNA in 10 µ L ddH2O aufgenommen. Die DNA-Sequenzierung erfolgte durch die Firma StarSeq (Mainz, Deutschland). Dazu wurden 6 µ L der gefällten DNA in ddH2O (entspricht ca. 400-700 ng DNA) mit 1 µ L des spezifischen Sequenzierprimers gemischt.

2.2.1.13. E. coli-Hitzeschock Analyse

Um die Chaperon-Eigenschaften von ausgewählten PDIs im lebenden Modellsystem näher zu untersuchen, wurde die modifizierte E. coli-Hitzeschock Analyse angewandt [156].

Dazu wurden E. coli Rosetta [pLysS] Zellen, welche mit dem entsprechenden Konstrukt bzw.

mit dem leeren Vektor (Kontrolle) transfiziert wurden, ü.N. bei 37 °C auf LB-Platten mit dem entsprechenden Antibiotikum kultiviert. Einzelne Kolone wurden gepickt und jeweils in 100 mL LB-Selektivmedium bis zu einer OD^600nm von ca. 0,4 kultiviert. Anschließend erfolgte die Induktion mit 0,5 mM IPTG ü.N. bei 30 °C. Die Zellsuspension wurde bei 4 °C und 3.000 g für 20 min zentrifugiert und das Zellpellet sofort in eiskaltem LB-Selektivmedium resuspendiert. Die OD^600nm wurde mit eiskaltem LB-Medium auf jeweils ca.

0,2 AU eingestellt. 1 mL-Aliquots der Zellsuspension wurden 0, 20 und 60 min bei 50 °C im Wasserbad inkubiert. Im Anschluss wurden jeweils 100 µ L mehrerer Verdünnungsreihen auf LB-Platten mit Antibiotikum ausplattiert und ü.N. bei 37 °C inkubiert. Die Platten wurden zur qualitativen Auswertung der gewachsenen Kolonien gescannt und digitalisiert.