General
characterisation
of
rhesus
macaque
lymphocytes
using
flow
cytometry

FITC.  No  proper  labelling  could  be  performed  with  DyLight405  (data  not  shown). 

Therefore, most of the experiments were performed using the anti‐rhesus macaque KIR  antibodies in the APC channel (DyLight633) of the flow cytometer.  

3.2 KIR
expression
pattern
in
primates
 


A lot is known about the expression pattern of KIR molecules on different lymphocyte  subsets  in  humans.  However,  the  rhesus  macaque  as  important  animal  model  is  not  well  studied  for  the  expression  of  these  receptors  so  far.  There  are  studies  analysing  the expression level of KIR mRNA (Bostik et al., 2009; Moreland et al., 2011) but not the  protein expression, due to the absence of specific anti‐rhesus macaque KIR antibodies  and  lack  of  cross  reactivity  of  anti‐human  KIR  antibodies  with  rhesus  macaque  KIR  proteins. 

The  characterisation  of  monoclonal  anti‐rhesus  macaque  KIR  antibodies  (3.1)  was  followed by their application to analyse the KIR expression on lymphocyte subsets of  rhesus  macaques  with  purified  and  fluorochrome‐labelled  antibodies  in  multi‐colour  flow cytometry. Eight animals were analysed for their KIR expression on NK cells and  different T cell subsets like CD8⁺, CD4⁺ αβ T cells and γδ T cells. For all animals the KIR  genotype was known and the frequency of transcript level was analysed as described  by Moreland and colleagues, 2011 (KIR transcript genotyping performed by Christina  Albrecht).   

3.2.1 General
characterisation
of
rhesus
macaque
lymphocytes
using
flow
cytometry
 


Rhesus macaque PBMC are similar to human PBMC, therefore, it is possible to use the  same  markers  for  most  of  the  surface  molecules  to  characterise  specific  cell  populations. All non‐KIR antibodies used here were established for human cell surface  markers but it was already shown that they also cross‐react with corresponding rhesus  macaque proteins (Mavilio et al., 2005). For all analysed PBMC samples of this work the  following gating strategy was applied (Figure
13).  

First,  all  doublets  were  excluded  using  the  FSC‐H  against  FSC‐A  (Monettes), 

remaining  monocytes  by  using  a  CD14  antibody  (Lymphoctes  exact)  and  further  analysed with CD20 (B cells) and CD3 (T cells) to exclude the CD20⁺ B cells (Figure
13a). 

To characterise the NK cells and different T cell subsets the remaining CD20^‐ and CD14^‐  population was used.  

NK  cells  of  rhesus  macaques  express  only  small  amounts  of  CD56  on  their  surface  (around  2  %  of  all  NK  cells  are  CD56⁺,  Webster  and  Johnson,  2005)  so  that  the  traditional  human  NK  marker  CD56  is  not  the  appropriate  marker  for  the  characterisation  of  rhesus  NK  cells.  However,  nearly  all  rhesus  macaque  NK  cells  express  NKG2A  (around  97  %,  Mavilio et  al.,  2005).  Therefore,  NKG2A  was  used  as  standard marker for the analysis of rhesus macaque NK cells in this work. All NK cells  are  also  CD8  positive  and  most  express  CD16,  so  these  markers  were  used  in  combination with NKG2A. Myeloid dendritic cells (mDC) also express CD16 in rhesus  macaques. Because of this, all CD16 positive cells had to be further analysed by gating  these  cells  with  CD16  against  CD8  to  exclude  the  CD8  negative  mDCs  (CD16  exact  population).  After  these  gating  steps  a  Boolean  gate  was  generated with  the  NKG2A  positive population and the CD16 exact population and these cells were defined as NK  cells (Figure
13b). 

Different T cell subsets were analysed like it is done for the human system using CD4,  CD8 and γδ‐TCR (Figure
13c). 

As a result of the analysis rhesus macaque lymphocytes have a similar composition as  human  lymphocytes.  There  are  between  3‐15  %  NK  cells  and  30‐70  %  of  all  lymphocytes are T cells. 37‐75 % are CD4⁺ αβ T cells, 17‐47 % of all T cells are CD8⁺ αβ  T cells and 2‐15 % express the γδ TCR (Figure
13d). 


 Figure
13.
Characterisation
of
rhesus
macaque
PBMC
using
multi‐colour
flow
cytometry.



(a)
Gating
to
exclude
doublets,
granulocytes
(size),
monocytes
(CD14)
and
B
cells
(CD20).
(b)
NK
cell
 gating
using
NKG2A
and
CD16
as
markers.
CD16
positive
cells
are
additionally
analysed
against
CD8
 to
exclude
mDCs.
All
NKG2A
and/or
CD16
positive
cells
were
combined
using
a
Boolean
gate.
(c)
T
 cell
 gating
 using
 CD4,
 CD8
 and
γδ
 TCR
 antibodies.
 (d)
 Overview
 of
 the
 percentage
 of
 all
 analysed
 lymphocyte
 populations.
 Shown
 is
 always
 the
 percentage
 of
 the
 parental
 population.
 The
 mean


Human NK cells express KIRs in a clonal pattern, i.e. each individual NK cell can express  a  unique  set  of  KIR  and  the  KIR  expression  differs  between  individuals.  So  far,  for  rhesus macaques it was not possible to characterise the KIR expression due to the lack  of antibodies. Here, NK cells were analysed for their KIR expression by flow cytometry  using pan‐KIR antibody 1C7, which recognises all tested KIR (3.1.5). The antibody was  labelled  with  DyLight633  for  all  experiments  shown  in  this  chapter.  The  already  described NK cell population (chapter 3.2.1) was analysed for its KIR expression as it is  shown as dot plots for four animals (Figure
14a). Figure
14b summarises the percentage  of KIR‐expressing NK cells for 8 different animals. Most of the animals were analysed  for  more  than  three  times  and  the  mean  of  the  percentage  of  these  experiments  is  shown  in  this  chart.  The  KIR  expression  over  time  was  very  constant  for  healthy  individuals  e.g.  Gerdi  (51.80‐55.7 %)  or  Happy  (85.3‐85.7 %)  (Figure
 36).  Further,  animals  differ  in  their  percentage  of  KIR‐expressing  NK  cells  (30‐80  %)  and  also  in  density, which is defined by the mean fluorescence intensity of KIR expression by these  NK cells (Figure
14c). Some animals have many KIR‐expressing NK cells but the density  of the expressed KIR is very low per cell, for example for Kalle (80 % KIR positive NK  cells, low MFI). The opposite of this is Benno where 50 % of all NK cells express KIR but  with the highest density of all animals (Figure
14 b/c).  

In  conclusion,  the  frequency  of  KIR‐expressing  NK  cells  as  well  as  the  amount  of  expressed  KIR  on  NK  cells  differ  between  animals.  There  is  no  clear  correlation  between  the  number  of  KIR‐expressing  NK  cells  and  the  density  of  expressed  KIRs  (Pearson r=0.3409, p=0.4086).  

Figure
14.
Flow
cytometry
analysis
of
expression
of
KIR
by
NK
cells.


Antibody
 1C7
 with
 a
 broad
 KIR
 reactivity
 (pan‐KIR)
 was
 used.
 (a)
 NK
 cell
 dot
 plot
 examples
 of
 different
animals
using
the
pan‐KIR
antibody
are
depicted.
Gates
for
KIR
positive
cells
were
defined
 referring
to
the
control
without
anti‐KIR
antibody.
(b)
Comparison
of
the
percentage
of
KIR
positive
 NK
cells
and
(c)
mean
fluorescence
intensity
(MFI)
using
1C7‐DyLight633
are
shown.