Expression
of
individual
KIR
by
NK
cells

An
antibody
with
a
broad
KIR
specificity
(pan‐KIR)
was
used.
(a)
Dot
plot
examples
of
the
analysed
 γδ
 T
 cell
 population
 of
 different
 animals
 using
 the
 pan‐KIR
 antibody.
 Gates
 for
 KIR
 positive
 cells
 were
defined
referring
to
the
control
without
anti‐KIR
antibody.
(b)
Comparison
of
the
percentage
 and
(c)
mean
fluorescence
intensity
(MFI)
of
all
tested
animals
using
1C7.


3.2.7 Expression
of
individual
KIR
by
NK
cells
 


KIR3DL05
Expression


KIR3DL05  expression  was  analysed  using  2H5‐DyLight633  antibody.  Between  0.9  to  15.6 % of all NK cells did express this KIR in eight tested animals (Figure
19). The MFI of  expressed  KIR3DL05  varied  between  167  and  662  for  the  tested  animals.  For  some  animals, there was only background signal detected with 2H5 (Bibbi, Gerdi, Kalle and  Happy). Therefore, all eight animals were genotyped for KIR3DL05 and two out of eight  (Gerdi  and  Happy)  were KIR3DL05  negative.  Transcript  analysis  showed  KIR3DL05  mRNA expression for five animals (Kalle, King, Benno, Jogi and Franz) (Table
4). Clear  surface expression was only observed for King and Benno (12.1 and 15.6 %). All other  animals  showed  only  low  numbers  of  KIR3DL05  positive  NK  cells  (less  than  3 %). 

Comparison with the total number of KIR‐positive NK cells (3.2.2) it is seen that not all  KIR‐expressing NK cells did express KIR3DL05. Therefore, KIR3DL05 is expressed in a  clonal  pattern.  In  addition,  the  variance  in  the  MFI  of  different  animals  showed  differences  in  the  amount  of  expressed  KIR3DL05.  No  correlation  between  the 

positive  NK  cells  did  not  automatically  have  the  highest  amount  of  this  KIR. 

Furthermore, the presence of the gene or mRNA did not always lead to detectable cell  surface expression of KIR3DL05 in these animals. 

Figure
19.
Flow
cytometry
analysis
of
expression
of
specific
KIR
by
NK
cells.
 


Three
different
antibodies
were
used.
Shown
is
the
number
of
KIR‐expressing
NK
cells
(%,
left
panel)
 and
the
level
of
KIR
expression
(MFI,
right
panel)
for
KIR3DL05
(2H5),
KIR3DLW03/KIR3DS05
(2H9),
 and
KIR3DSW08/KIR3DS07/KIR3DL07
(2H3)
(n=8
for
2H5
and
n=7
for
2H9
and
2H3).


KIR3DLW03/KIR3DS05
Expression


The  expression  of  KIR3DLW03/KIR3DS05  was  observed  for  six  out  of  seven  animals  using 2H9‐DyLight633 antibody (Franz was so far not analysed with this antibody). Jogi  did  not  show  any  KIR3DLW03/KIR3DS05‐positive  NK  cells  (Figure
 19).  The  range  of  positive  NK  cells  for  the  other  animals  was  between  4.3  to  26.9  %,  with  a  varying  amount  of  KIR  surface  expression  between  animals  (MFI  271‐2204)  (Figure
 19). 

Genotyping  identified KIR3DLW03/KIR3DS05 in  all  animals.  Transcripts  of  KIR3DS05  were observed for all animals except Jogi and KIR3DLW03 mRNA was only found for  Happy and Jogi (Table
4). Jogi did not show any surface expression of KIR3DLW03 and  for  Happy  it  was  not  possible  to  distinguish  between  KIR3DLW03  and  KIR3DS05  expression  using  2H9.  For  all  other  animals  the  detected  expression  was  due  to  KIR3DS05  because  of  the  absence  of  KIR3DLW03  transcripts.  As  for  KIR3DL05,  the  expression pattern of KIR3DLW03/KIR3DS05 was observed to be clonal with a varying  amount of KIR for different animals. No correlation between the two values was found  (Pearson r=0.4069, p=0.4233). 

Table
4.
Summary
of
genotyping,
transcript
and
protein
surface
expression
of
certain
KIR
for
eight
 analysed
rhesus
macaques.


Shown
are
the
data
for
the
KIR
genotyping,
where
+
indicates
the
presence
and
–
the
absence
of
a
 gene.
The
transcript
data
were
derived
from
454
amplicon
sequencing
analysing
cDNA
from
total
 mRNA
 of
 PBMCs
 (data
 provided
 by
 Christina
 Albrecht,
 Abteilung
 Primatengenetik,
 DPZ).
 The
 percentage
 of
 the
 total
 read
 number
 is
 shown.
 –
 indicates
 the
 absence
 of
 any
 transcript.
 Protein
 expression
was
analysed
by
three
different
antibodies
(2H5,
2H9
and
2H3)
labelled
with
DyLight633.


Shown
are
the
percentage
of
positive
cells
and
the
MFI
for
NK
cells,
CD8⁺
αβ
T
cells
and
γδ
T
cells.


KIR3DS05
 _{3.78
 8.51
 8.72
 33.41
 8.20
 7.14
 ‐
 18.10}

mRNA
 (%
of
total
reads)


KIR3DL07
 _{‐
 1.87
 27.77
 ‐
 11.00
 10.45
 21.76
 2.30}

NK
cells
 0.9/167
 1.1/205
 2.8/189
 1.7/250
 12.1/229
 15.6/662
 1.5/377
 2.8/310
 CD8⁺
T
cells
 0.7/62
 0.6/122
 1.3/85
 1.8/140
 4.1/42
 2.7/267
 1.7/264
 0.8/267
 2H5


γδ
T
cells
 2.2/112
 4.1/218
 3.4/122
 3.5/186
 2.0/27
 14.6/690
 8.2/505
 19.4/727
 NK
cells
 7.3/271
 11.6/359
 4.3/283
 18.9/860
 26.9/925
 11.2/2204
 0.8/330
 ‐
 CD8⁺
T
cells
 0.8/118
 1.7/110
 1.3/139
 4.4/196
 4.9/217
 0.6/127
 1.7/275
 ‐
 2H9


γδ
T
cells
 2.7/182
 13.8/476
 2.7/215
 10.4/331
 34.1/1575
 1.9/167
 7.7/528
 ‐
 NK
cells
 2.2/163
 3.7/233
 9.2/416
 55.9/1725
 31.4/1525
 20.9/1677
 7.2/546
 ‐
 CD8⁺
T
cells
 1.2/118
 2.9/158
 5.2/233
 11.1/372
 5.98/289
 2.7/244
 16.2/688
 ‐


Protein
 (%/mean)
 2H3



 γδ
T
cells
 4.9/245
 17.5/665
 6.8/317
 14.8/559
 35.9/1863
 17.7/625
 26.1/1155
 ‐


KIR3DSW08/KIR3DS07/KIR3DL07
Expression


The  expression  of  these  KIRs  was  analysed  for  seven  animals  (all  except  Franz)  and  observed  for  2.2‐55.9  %  of  all  NK  cells  with  a  varying  amount  (MFI  163‐1725)  using  2H3‐DyLight633 (Figure
19).  

The  KIR3DS07  gene  was  detected  in  genomic  DNA  of  Happy,  King,  Benno,  Franz,  and  Jogi but no mRNA of this KIR gene was observed for any of the animals (Table
4). The 

KIR3DL07  was  negative  for  Bibbi,  King,  and  Benno,  respective  mRNA  was  detected  (Table
 4).  The  DNA  genotyping  might  miss  the  detection  of  certain KIR3DL07  alleles; 

therefore, this method needs to be optimised. Happy, the animal with the most positive  NK cells for KIRs as measured with 2H3 (Figure
19), did not show transcripts for any of  the three analysed KIRs (Table
4). Therefore, either the amplicon sequencing needs to  be improved, or 2H3 might detect KIR proteins that are not known or not covered by  any of the methods applied here. In those cases where the specific gene was typed as 

“present”  and  mRNA  was  not  detected,  the  respective  KIR  is  either  not  expressed  or  only on very low levels that preclude detection by 454 amplicon sequencing. This might  be the case for the KIR3DSW08 gene, which is obviously present in all animals analysed,  but only Jogi showed KIR3DSW08 transcripts (Table
4).  

For the expression of the KIR molecules detected by 2H3 a significant correlation of the  frequency  of  KIR3DSW08/KIR3DS07/KIR3DL07  positive  NK  cells  and  the  amount  of  expressed KIR was observed (Pearson r=0.8468, p=0.0334). 

3.2.8 Expression
of
individual
KIR
by
different
T
cell
subsets
  

Different T cell subsets were also analysed for their expression of individual KIR using  the antibodies 2H5, 2H9, and 2H3. All CD8⁺ αβ and γδ T cells were characterised for  their  expression  of  KIR3DL05,  KIR3DLW03/KIR3DS05  and  KIR3DSW08/KIR3DS07/KIR3DL07, respectively. The animals included in this analysis  were the same as for the NK cells in the chapter before. 

KIR3DL05 is expressed by 0.5‐4 % of CD8⁺ αβ T cells and by 2‐20 % of γδ T cells (Figure
 20).  1.5‐16 %  of  all  CD8⁺  αβ  T  cells  were  positive  for  KIR3DSW08/KIR3DS07/ 

KIR3DL07 with the 2H3 antibody and 5‐37 % of the γδ T cells. KIR3DLW03/KIR3DS05  was detected on 0.3‐5 % of CD8⁺ αβ T cells and on 2‐35 % of γδ T cells using the 2H9  antibody. Comparison of the detected percentages for certain KIRs with the total KIR  expression  of  both  CD8⁺  αβ  and  γδ  T  cells  (3.2.4,  3.2.6)  showed  similar  to  NK  cells  a  clonal  expression  pattern  of  certain  KIRs  for  these  cell  subsets.  Furthermore,  the  amount of expressed KIRs differs between animals.