Funktionen des FEAR Netzwerk

Cdc14 freigesetzt durch das FEAR Netzwerk katalysiert in der frühen Anaphase multiple Ereignisse, die es der Zelle erlauben, erfolgreich diese Phase zu durchlaufen und letztendlich aus der Mitose auszutreten. Dazu gehören die Initiation des MEN, die Stabilisierung der Spindel, die Positionierung des Zellkerns und die Trennung der rDNA.

3.3.6.1 Initiierung des MEN

Zum einen trägt die Polo-Kinase Cdc5 durch Phosphorylierung der MEN-Komponenten Bfa1 und Lte1 zur Aktivierung von Tem1 und damit zur Initiierung des MEN bei (Kapitel 3.3.4 und 3.3.7). Zum anderen wirkt Cdc14, das innerhalb des FEAR freigesetzt wird durch die

Dephosphorylierung von Cdc15 positiv regulatorisch auf die Aktivierung des MEN.

Zusätzlich wird ein negativer Regulator des MEN PP2A^Cdc55 von der Separase Esp1 abgebaut [Queralt et al. 2006].

3.3.6.2 Die Stabilisierung der Anaphase-Spindel und Kernpositionierung

Metaphase Mikrotubuli zeigen eine hohe Dynamik, die notwendig ist, um die Anheftung an die Schwester-Chromatiden zu gewährleisten. Für eine korrekte Trennung der Chromosomen ist es jedoch notwendig, dass die Mikrotubuli Dynamik zu Beginn der Anaphase mit der Elongation der mitotischen Spindel abnimmt [Higuchi & Uhlmann 2005]. Außerdem ist der Mittelteil der mitotischen Spindel (spindle midzone) durch die schnelle Elongation äußerst fragil und muss stabilisiert werden. Durch die Dephosphorylierung von Sli15 durch Cdc14 lokalisiert der Ipl1-Sli15-Bir1 Komplex an der spindle midzone und trägt auf diese Weise zur Rekrutierung von Slk19 bei [Pereira & Schiebel 2003]. Weiterhin werden Ase1 ein konserviertes Mikrotubuli Protein und Fin1 durch Cdc14 dephosphoryliert und dadurch an der mitotischen Spindel lokalisiert [Khmelinskii et al. 2007, Woodbury & Morgan 2007]. Ase1 trägt zusammen mit Slk19 zu einem fokussierten und zentrierten Mittelteil der mitotischen Spindel bei. Zusätzlich wird die Abnahme der Mikrotubulidynamik durch die Cdc14-abhängige Dephosphorylierung von Ask1, Stu1 und Cin8 reguliert [Higuchi & Uhlmann 2005].

Das FEAR Netzwerk und die innerhalb dessen freigesetzte Phosphatase Cdc14 regulieren außerdem Kräfte, die von den zytoplasmatischen Mikrotubuli ausgehen, so dass eine korrekte Aufteilung der Schwester-Chromatiden in Tochter-und Mutterzelle stattfinden kann. Kar9, ein Mikrotubuli assoziiertes Protein, könnte ein mögliches Zielprotein der Phosphatase sein [D’Amours & Amon 2004]. Während der Metaphase lokalisiert Kar9 an dem Spindelpolkörper und den zytoplasmatischen Mikrotubuli, die zur Tochterzelle ausgerichtet sind, um die Spindel und somit den Zellkern zur Knospe hin zu positionieren [Liakopoulos et al. 2003, Maekawa et al. 2003]. Inwieweit die Phosphorylierung von Kar9 bei seiner asymmetrischer Lokalisation während der Metaphase eine Rolle spielt, ist umstritten [Liakopoulos et al. 2003, Maekawa & Schiebel 2004]. Zu Beginn der Anaphase ändert sich die Kar9 Lokalisation und eine verminderte Phosphorylierung des Proteins ist zu detektieren [Liakopoulos et al. 2003, Maekawa et al. 2003]. Im Gegensatz zu seiner Metaphase-Lokalisation an nur einem Spindelpol, der zur Tochterzelle orientiert ist, lokalisiert Kar9 in der frühen Anaphase an beiden Spindelpolen [Maekawa et al. 2003], so dass auf diese Kräfte einwirken, die eine symmetrische Verteilung der Schwester-Chromatiden auf Tochter- und

Mutterzelle zur Folge haben. Vor allem die Änderung im Phosphorylierungsmuster von Kar9 zu Beginn der Anaphase würde es zu einem geeigneten Substrat der Cdc14 Phosphatase machen. Es gibt jedoch noch weitere Motorproteine, die CDK-abhängig phosphoryliert werden und somit Zielproteine von Cdc14 darstellen könnten, um eine korrekte Positionierung des Zellkerns während der Anaphase zu gewährleisten [D’Amours & Amon 2004].

3.3.6.3 Die Trennung der rDNA

Bereits 1991 in einer Publikation von Granot & Snyder konnte gezeigt werden, dass die Trennung des Nukleolus ein Cdc14-abhängiger Prozess zu sein scheint.

Die Nukleolustrennung wird nicht wie der Rest des Genoms in der Metaphase eingeleitet sondern erst zu Beginn der Anaphase nach der Aktivierung der Phosphatase Cdc14. Für die Trennung der rDNA ist außer der Auflösung der Cohesin-abhängigen Kohäsion noch die Cdc14-abhängige Trennung der an diesem DNA Locus bestehenden Cohesin-unabhängigen Kohäsion notwendig. Durch das aktive Cdc14 zu Beginn der Anaphase wird der heteropentamere Condensin-Komplex an den rDNA Locus rekrutiert, um dessen Aufteilung auf Mutter-und Tochterzelle einzuleiten [D’Amours et al. 2004, Sullivan et al. 2004, Torres-Rosell et al. 2004, Wang et al. 2004]. Die rDNA Trennung gliedert sich in zwei Prozesse, die Kompaktierung des rDNA Locus und die Auflösung der Cohesin-unabhängigen Kohäsion an der rDNA [Machín et al. 2005, Sullivan et al. 2004]. Ohne Kompaktierung der 5 µm langen rDNA Schleife kann eine vollständige Trennung der rDNA in der 8-10 µm langen Hefe nicht stattfinden, wobei die Kondensation dieses Gen Locus in der Anaphase abhängig ist von Condensin und dem Ipl1-Sli15 Komplex [Lavoie et al. 2004, Sullivan et al. 2004]. Die Rate der Kompaktierung der rDNA in der Metaphase liegt bei 200 kb/µm und während der Anaphase erreicht sie 400-500 kb/µm [Sullivan et al. 2004]. Die letztendliche Auflösung der Cohesin-unabhängigen Kohäsion der rDNA ist abhängig von Condensin jedoch unabhängig von Ipl1-Sli15 [D’Amours et al. 2004, Sullivan et al. 2004, Wang et al. 2004]. Bei der Anreicherung von Condensin an der rDNA während der Anaphase scheint sein Sumoylierungszustand eine Rolle zu spielen. Vor dem Eintritt in die Mitose ist die Condensinuntereinheit Ycs4 monosumoyliert, aber zu Beginn der Anaphase ist Ycs4 disumoyliert. In cdc14 Mutanten ist die Anaphase-spezifische sumoylierte Form der Condensinuntereinheit stark reduziert [D’Amours et al. 2004], was die Schlussfolgerung zulässt, dass die Sumoylierung von Condensin in Abhängigkeit von Cdc14 abläuft.

Sullivan et al. 2004 schlagen vor, dass neben Condensin die Aktivität der Topoisomerase II benötigt wird, um die an der rDNA bestehende Cohesin-unabhängige Kohäsion zu trennen, da in top2 Mutanten der Nukleolus ungetrennt bleibt. D’Amours et al. 2004 schlossen eine Beteiligung der Topoisomerase II an der rDNA Trennung jedoch aus, da eine Überexpression von Cdc14 in top2 Mutanten die Trennung der rDNA induzieren kann. Eine hohe Menge an Cdc14 unterdrückt also den Bedarf der Topoisomerase II an der rDNA Trennung.

Jüngste Studien weisen darauf hin, dass die Cohesin-unabhängige Kohäsion an der rDNA verursacht wird durch die hohe Transkriptionsrate dieses Locus [Machín et al. 2006, Tomson et al. 2006]. Die Reduktion der rDNA Transkription durch die Deletion von NET1 oder die Inaktivierung der RNA Polymerase I führt zu einer Verminderung der rDNA Trennungsdefekte in cdc14 Mutanten [Machín et al. 2006, Tomson et al. 2006]. Die rRNA Transkripte und/oder die an diesen assemblierten Faktoren könnten eine Kohäsion an den Genen der rDNA schaffen, die durch einen zusätzlichen Cohesin-unabhängigen Mechanismus gelöst werden muss [Tomson et al. 2006]. Die Publikation von Machín et al. 2006 beschreibt außerdem eine Funktion von Fob1 bei der Trennung der rDNA zusätzlich zu seiner FEAR und RFB (replication fork block) Funktion, da durch die Deletion von FOB1 der Phänotyp einer cdc14 Mutante verstärkt wird. Aufgrund einer Publikation von Johzuka et al. 2006 nach der Fob1 eine Rolle in der Rekrutierung von Condensin an die rDNA spielt, nehmen die Autoren einen Zusammenhang in der Fob1-abhängigen Bindung von Condensin an der rDNA und seiner Funktion in der rDNA Trennung an. Die genauen molekularen Mechanismen der rDNA Trennung müssen jedoch noch intensiver analysiert werden.