Die Inhibition der Phosphatase Cdc14

Die Inhibition der Aktivität von Cdc14 wird durch die Net1-abhängige Verankerung innerhalb einer Substruktur des Zellkerns, dem Nukleolus, gewährleistet. Somit kommt dem Nukleolus nicht nur eine Bedeutung bei der Ribosomenbiogenese zu sondern auch innerhalb der Regulation der Mitose, was ihn zum Gegenstand verschiedener Forschungsprojekte macht.

3.3.2.1 Struktur des Nukleolus und Anordnung der rDNA

Der Nukleolus ist eine Substruktur des Zellkerns, in der die rRNA Synthese und die Ribosomenassemblierung stattfinden [Tschochner & Hurt 2003]. Die ribosomale DNA (rDNA) der Hefe S. cerevisiae ist eine Region von circa 1-2 Mb auf dem rechten Arm des Chromosoms XII, die 100-200 Tandem Wiederholungen eines 9,1 kb großen rDNA Bereichs umfasst [Petes & Botstein 1977]. Jede Wiederholung enthält Gene, die für die 5S, 5,8S, 25S und 18S rRNAs codieren als auch Spacer Regionen. Es gibt die ITS1 und 2 (internal transcribed spacer), die 5’ ETS und 3’ETS (external transcribed spacer) und die NTS1 und 2 (nontranscribed spacer) (Abbildung 3.3). Gene, die für die 5,8S, 25S und 18S rRNA codieren, werden von der RNA Polymerase I transkribiert, wobei die Transkription an der 5’ETS startet und an der 3’ETS endet, so dass ein 35S Primärtranskript entsteht. Die 5S rRNA wird von der RNA Polymerase III transkribiert. Um Rekombination an diesem großen, repetitiven Gen Locus gering zu halten und die Transkription durch die RNA Polymerase II zu verhindern, findet nukleolares silencing statt (Kapitel 3.3.2.2).

Das Erscheinungsbild der Nukleoli variiert stark in Abhängigkeit vom Zelltyp. Die rDNA humaner Zellen ist auf fünf verschiedene Chromosomen verteilt, was deren Organisation erschwert. In S. cerevisiae erscheint der Nukleolus als halbmondförmige Struktur, die direkt neben dem Zellkern zu liegen scheint [Carmo-Fonesca et al. 2000]. Während der Mitose bleibt er intakt und wird entlang der mitotischen Spindel aufgetrennt. Die Nukleoli höherer Eukaryonten erscheinen meist als kugelförmige Gebilde [Shaw & Doonan 2005], die aus drei Hauptkomponenten, dem fibrillären Zentrum, dem dichten fibrillären Zentrum und der granulären Komponente bestehen und deren Organisation sich während der Mitose auflöst.

Léger-Silvestre et al. 1999 konnte zeigen, dass auch der Nukleolus von S. cerevisiae Subkompartimente ähnlich denen höherer Organismen aufweist.

Abbildung 3.3: Die Organisation der rDNA – eine rDNA-Einheit

100-200 Wiederholungen einer solchen rDNA Einheit liegen auf dem langen Arm des Chromosom XII. Jede Wiederholung enthält Gene, die für die 5S, 5,8S, 25S und 18S rRNAs codieren als auch die Spacer Regionen NTS1, NTS2, 5’ETS, 3’ETS, ITS1 und ITS2.

3.3.2.2 Net1 - Inhibitor von Cdc14, Sir2-Verankerung, nukleolare Strukturkomponente Net1, auch als Cfi1 und Ecs5 bekannt, ist ein 1189 Aminosäure großes Strukturprotein des Nukleolus und stellt die Hauptkomponente des so genannten RENT-Komplexes (regulator of nucleolar silencing and telophase) dar (Abbildung 3.4). Die Funktionen des RENT-Komplexes liegen in der Cdc14 Regulation während der Mitose [Shou et al. 1999] und der Bindung von Sir2 an die rDNA [de Almeida et al. 1999, Straight et al. 1999]. Durch die Verankerung von Cdc14 im Nukleolus wird die Aktivität dieses Proteins reguliert. Die Net1 Bindungsstelle für die Phosphatase liegt innerhalb des konservierten N-Terminus von Cdc14 im Bereich des katalytischen Zentrums (AS 279-291) [Traverso et al. 2001]. Net1 trägt also nicht nur zur Lokalisation der Phosphatase Cdc14 bei sondern auch zu deren Inhibition, wobei die ersten 341 Aminosäuren von Net1 notwendig und hinreichend sind für eine Interaktion mit Cdc14 [Traverso et al. 2001]. Die Phosphorylierung von Net1 zu Beginn der Anaphase bewirkt die Freisetzung und Aktivierung der Phosphatase Cdc14 (Kapitel 3.3.5) [Shou et al.

2002, Azzam et al. 2004]. Aufgrund der Inhibition von Cdc14 durch Net1 ist eine Überexpression von NET1 toxisch für die Zellen, die daraufhin in der späten Anaphase bzw.

frühen Telophase arretieren [Visintin et al. 1999].

Durch das über Net1 gebundene Sir2, eine Histon-Deacetylase, werden Rekombinations-ereignisse an der rDNA unterdrückt [Gottlieb & Esposito 1989] und rDNA-silencing vermittelt, was die RNA Polymerase II-abhängige Transkription verhindert [Smith & Boeke 1997]. Die Inhibition von Rekombinationereignissen zwischen den rDNA Wiederholungen ist notwendig, um die Entstehung kleiner zirkulärer DNA-Fragmente zu verhindern, die sich beschleunigend auf die Zellalterung auswirken [Sinclair & Guarente 1997]. Die Inhibition der rDNA Rekombination und das rDNA-silencing werden wahrscheinlich durch eine Konformationsänderung in der rDNA beeinflusst, die durch die Histon-Deacetylase Aktivität von Sir2 hervorgerufen werden könnte.

Der RENT-Komplex wird über Fob1 an die NTS1 Region der rDNA rekrutiert, wobei der N-terminale Teil von Net1 ausreichend ist für die Cdc14 und Fob1 Bindung [Traverso et al.

2001, Stegmeier et al. 2004]. Fob1 hilft die Cdc14 Dissoziation von Net1 zu verhindern [Stegmeier et al. 2004]. Es ist im Gegensatz zu Sir2 ein positiver Regulator der rDNA Rekombination. Fob1 blockiert das Voranschreiten der Replikationsgabel [Kobayashi &

Horiuchi 1996], was zu Doppelstrangbrüchen führen kann und so Rekombinationsereignissen erzeugt. Durch die Interaktion von Fob1 mit dem nukleolaren Protein Tof2 werden zusätzlich zu Sir2 weitere negative Regulatoren der Rekombination, Lrs4 und Csm1, an die NTS1 Region der rDNA rekrutiert [Huang et al. 2006] (Kapitel 3.4).

Außerdem ist der RENT-Komplex mit einer rDNA Region assoziiert, die circa 1,5-2 kb der NTS2 Region und der 35S rRNA codierenden Sequenz umfasst [Huang & Moazed 2003]. Die Bindung an diese rDNA Region ist Fob1 unabhängig. Ein möglicher Kandidat für die Rekrutierung des RENT-Komplexes an diese Region könnte die RNA Polymerase I und/oder assoziierte Transkriptionsfaktoren sein [Huang & Moazed 2003]. Diese Hypothese wird dadurch unterstützt, dass Net1 mit der RNA Polymerase I in vivo und in vitro interagiert und deren Aktivität in vitro stimuliert [Shou et al. 2001]. Zudem ist das rDNA-silencing unterdrückt in Zellen, die keine funktionelle RNA Polymerase I aufweisen [Buck et al. 2002].

Weiterhin stellt Net1 eine wichtige Strukturkomponente des Nukleolus dar. In net1-Deletionsmutanten, die im W303 Stammhintergrund der Hefe S. cerevisiae lebensfähig sind, ist die nukleolare Struktur zerstört. Nukleolare Protein, die nicht direkt über Net1 im Nukleolus verankert sind wie Nop1 und Nop2 sind delokalisiert [Shou et al. 2001].

Abbildung 3.4: Eine schematische Darstellung des RENT-Komplexes und seiner nukleolaren Verankerung [verändert nach Shou et al. 1999]

Net1 stellt die Hauptkomponente des RENT-Komplexes dar. Neben Cdc14 ist auch Sir2, eine Komponente des nukleolaren silencing, an Net1 gebunden. Die Bindung des RENT an die NTS1 Region der rDNA erfolgt über Fob1, während die Interaktion mit Teilen der NTS2 Region und der für die 35S rRNA codierenden Sequenz evtl.

über die RNA Polymerase I bewerkstelligt werden könnte.