Funktioneller Nachweis des MCR und des YR

PVN-Neuronen zeichnen sich durch den Besitz von MCR sowie YR aus, womit sie Signale der POMC/CART- und NPY/AgRP-Neuronen des ARC verarbeiten können (GERALD et al.

1996; KIM et al. 2000; SHUKLA et al. 2012). Zunächst stellte sich die Frage, ob diese Rezepto-ren in den mHypoA-2/10-CRE-Zellen endogen exprimiert werden. Hierfür wurde die cAMP-Akkumulation nach Stimulation der Zellen mit α-MSH oder NPY analysiert. Beim Vorhandensein von Gs-gekoppelten MCR würde man eine Zunahme der cAMP-Akkumu-lation nach StimucAMP-Akkumu-lation der Zellen mit α-MSH erwarten. Durch die StimucAMP-Akkumu-lation Gi/o -gekop-pelter YR mit NPY würde man eine Abnahme der cAMP-Akkumulation feststellen. Die Zel-len wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen α-MSH (von 1 pM bis 10 µM) stimuliert;

anschließend wurde die cAMP-Akkumulation bestimmt. In Abbildung 5.1 ist die α-MSH-induzierte cAMP-Akkumulation als Quotient (cAMP/(cAMP+ATP)) in Abhängigkeit von der Konzentration dargestellt. Die cAMP-Akkumulation der mit 1 oder 10 µM α-MSH sti-mulierten Zellen unterschied sich signifikant von der cAMP-Akkumulation, welche von 1 pM α-MSH induziert wurde. Der berechnete EC50 Wert, d. h. die Konzentration von α-MSH mit halbmaximaler cAMP-Akkumulation, lag in mHypoA-2/10-CRE-Zellen bei 77,9 ± 31,7

74 nM. Der EC50 für α-MSH auf cAMP-Ebene lag bei einer höheren Konzentration als in ver-gleichbaren Zellsystemen (DAMM et al. 2012).

Abbildung 5.1: α-MSH-induzierte cAMP-Akkumulation in mHypoA-2/10-CRE-Zellen

mHypoA-2/10-CRE-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen α-MSH (1 pM bis 10 µM) stimuliert. Der EC50

Wert für α-MSH auf cAMP-Ebene lag bei 77,9 ± 31,7 nM. Dargestellt sind die Mittelwerte ± S.E.M. von vier unabhängigen Experimenten. Signifikante Unterschiede wurden mittels ANOVA und anschließendem Post-hoc-Test nach Dunnett er-mittelt.

Im Gegensatz zu den Gs-gekoppelten Rezeptoren wird durch die Stimulation Gi/o -gekoppel-ter Rezeptoren, wie die YR, die Stimulation der AC und in Folge dessen auch die cAMP-Akkumulation inhibiert (WETTSCHURECK UND OFFERMANNS 2005). Neben der Untersu-chung, ob NPY die FSK-vermittelte cAMP-Akkumulation inhibiert, stellte sich auch die Frage, ob NPY als funktioneller Gegenspieler zu α-MSH im PVN einen direkten Effekt auf die α-MSH-vermittelte cAMP-Akkumulation hat (COWLEY et al. 1999). Abbildung 5.2A zeigt ein Beispiel eines Experiments, wobei die basale sowie die Liganden-induzierte cAMP-Akkumulation durch α-MSH, α-MSH und NPY, FSK oder FSK und NPY bestimmt wurde.

Der AC-Aktivator FSK diente dabei als Positivkontrolle. Die FSK-induzierte cAMP-Akku-mulation ließ sich signifikant durch die Anwesenheit von NPY inhibieren. Wie auch schon in Abbildung 5.1 dargestellt, führte die Stimulation von mHypoA-2/10-CRE-Zellen mit α-MSH zu einem signifikanten Anstieg der cAMP-Akkumulation. Durch die Stimulation in Gegenwart von NPY konnte das Signal signifikant unterdrückt werden. Die durch α-MSH gebildete cAMP-Menge war im Vergleich zur FSK-induzierten cAMP-Akkumulation deut-lich geringer, was im Falle eines endogen exprimierten Rezeptors auch so zu erwarten war.

In Abbildung 5.2B ist dargestellt, um wie viel Prozent das α-MSH- oder FSK-vermittelte

-12 -10 -8 -6

500 1000 1500

α-MSH [log M]

cAMP-Akkumulation [cAMP/(cAMP+ATP)]

# ##

75 cAMP-Signal durch NPY inhibiert wurde. NPY inhibierte die α-MSH-induzierte cAMP-Ak-kumulation signifikant um 29 ± 6 % und die FSK-vermittelte cAMP-AkcAMP-Ak-kumulation um 31

± 10 %. Die endogene Expression von MCR und YR in mHypoA-2/10-CRE-Zellen (Abbildung 5.1 und Abbildung 5.2) schuf gute Voraussetzungen, um diese Zelllinie als Zell-modell für PVN-Neurone nutzen zu können.

Abbildung 5.2: Inhibitorischer Effekt von NPY auf die α-MSH- und FSK-vermittelte cAMP-Akkumulation

(A) Repräsentatives Beispiel für den Effekt von 100 nM NPY auf die durch 1 µM α-MSH- und 10 µM FSK-induzierte cAMP-Akkumulation. Signifikante Unterschiede wurden mittels ANOVA und anschließendem Post-hoc-Test nach Dunnett (#) ermittelt, beim Vergleich zweier Bedingungen wurde ein ungepaarter Student’s t-test (*) angewandt.

(B) Prozentuale Inhibition der α-MSH- und FSK-vermittelten cAMP-Akkumulation in Anwesenheit von NPY. Das durch α-MSH- oder FSK-induzierte cAMP-Signal wurde als 100 % definiert. Das Signal in Anwesenheit von NPY wurde dazu ins prozentuale Verhältnis gesetzt und von 100 subtrahiert. Es wurde die Inhibition der Liganden-induzierten cAMP-Akku-mulation durch NPY aus acht (α-MSH) und vier (FSK) unabhängigen Versuchen in % dargestellt. Die Prüfung der Werte auf signifikante Unterschiede erfolgte mittels Einstichproben-t-Test.

Zur Untersuchung, ob in mHypoA-2/10-CRE-Zellen eine CRE-Reporteraktivität durch α-MSH induziert werden kann und wie lange die Zellen dafür stimuliert werden müssen, wurde eine Kinetik erstellt. Hierfür wurden die Zellen für 30 min, 1 h, 4 h und 6 h mit α-MSH stimuliert (Abbildung 5.3). Die α-α-MSH-induzierte CRE-Reporteraktivität unterschied sich nach 1 h, 4 h und 6 h signifikant von der basalen CRE-Aktivität der mHypoA-2/10-Zellen. Eine Stimulationszeit von 30 min war nicht ausreichend, um eine CRE-Reporteraktivierung zu bewirken. Für alle weiteren Versuche wurde eine Stimulationszeit von 4 h gewählt, da eine längere Stimulation nicht zu einer Erhöhung des Signals führte.

basal MSH

MSH +NPY

FSK FSK+NPY 0

2500 5000 7500 10000 12500 15000

Liganden-induzierte cAMP-Akkumulation [DPM]

## #

###

###

*

A *

MSH FSK

-50 -40 -30 -20 -10 0

NPY-induzierte Inhibition der Liganden-induzierten cAMP-Akkumulation [%]

**

B

76

Abbildung 5.3: Kinetik der α-MSH-vermittelten CRE-Reporteraktivierung in mHypoA-2/10-CRE-Zellen

mHypoA-2/10-CRE-Zellen wurden für 30‘, 1 h, 4 h und 6 h mit 1 µM α-MSH stimuliert. Dargestellt sind die Mittelwerte + S.E.M. der CRE-Reporteraktivität aus drei unabhängigen Experimenten. Signifikante Unterschiede wurden mittels ANOVA und anschließendem Post-hoc-Test nach Dunnett ermittelt.

Für die weitere Charakterisierung der mHypoA-2/10-CRE-Zellen war es von Interesse zu analysieren, ob das Signal MCR-spezifisch ist und welcher MCR-Subtyp endogen exprimiert wird.

Durch die Verwendung von HS024 konnte der Nachweis erfolgen, dass es sich bei dem ge-messenen CRE-Reportersignal aus Abbildung 5.3 um ein MCR-vermitteltes Signal handelt.

Bei HS024 handelt es sich um einen MC4R-Antagonisten. Durch die Verwendung von 1 µM HS024 war zu erwarten, dass alle MC1R, MC3R, MC4R und MC5R blockiert wurden, da der Ki für HS024 für diese Subtypen im Bereich zwischen 0,29 nM (MC4R) bis 18,6 nM (MC1R) liegt (KASK et al. 1998). Im PVN wurden jedoch nur MC3R und MC4R erwartet (KIM et al.

2000; WISSE UND SCHWARTZ 2001; SHUKLA et al. 2012). Für den Nachweis von MCR wurden mHypoA-2/10-CRE-Zellen mit 100 nM α-MSH oder 100 nM α-MSH in Gegenwart von 1 µM HS024 stimuliert (Abbildung 5.4). In stimulierten Zellen war die CRE-Reporteraktivie-rung gegenüber der Ausgangssituation signifikant erhöht. In Anwesenheit von HS024 war die α-MSH-vermittelte CRE-Aktivität weniger stark erhöht und konnte als Bestätigung für das Vorhandensein von MCR angesehen werden.

basal 30' 1h 4h 6h 0

1000 2000 3000 4000 5000

α-MSH-induzierte CRE-Reporteraktivität [w. E.]

## ## ##

77

Abbildung 5.4: α-MSH-vermittelte CRE-Reporteraktivität in Abhängigkeit des MC4R-Antagonisten HS024

mHypoA-2/10-CRE-Zellen wurden für 4 h mit 100 nM α-MSH oder 100 nM α-MSH und 1 µM HS024 stimuliert. Es sind die Mittelwerte + S.E.M aus drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Signifikante Unterschiede wurden mittels ANOVA und anschließendem Post-hoc-Test nach Dunnett (#) ermittelt, beim Vergleich zweier Bedingungen wurde ein ungepaarter Student’s t-test (*) angewandt.

Da sowohl der MC3R als auch der MC4R im Hypothalamus exprimiert werden, wobei dem MC4R bei der Appetitregulation eine zentrale Bedeutung zugesprochen wird, bestand Inte-resse daran, den MCR-Subtyp zu bestimmen (KIM et al. 2000; WISSE UND SCHWARTZ 2001;

SHUKLA et al. 2012). Diese Unterscheidung ist durch α-MSH nicht möglich, da es sich um einen Agonisten für den MC3R und den MC4R handelt. Um zwischen dem MC3R und dem MC4R differenzieren zu können, bot sich die Stimulation der Zellen mit γ-MSH an. γ-MSH ist ein selektiver MC3R-Agonist, dessen EC50 Wert für den MC4R 50-fach höher ist als für den MC3R (MACNEIL et al. 2002). Daher wurden Konzentrations-Wirkungs-Kurven (KWK) für α-MSH und γ-MSH erstellt (Abbildung 5.5). Für α-MSH sah man einen deutli-chen konzentrationsabhängigen Anstieg der CRE-Reporteraktivität, wobei der ermittelte EC50 Wert von 5,6 ± 1,4 nM mit den in der Literatur beschriebenen Werten übereinstimmte (OOSTEROM et al. 1999; DAMM et al. 2012). Der EC50 Wert von γ-MSH lag für die CRE-Reporteraktivität bei 10,5 ± 8,8 µM. Da der EC50 Wert von γ-MSH für den MC3R laut Lite-ratur bei etwa 6 nM liegt und für die mHypoA-2/10-CRE-Zellen deutlich höher war, konnte man davon ausgehen, dass das in den mHypoA-2/10-CRE-Zellen gemessene CRE-Signal durch den MC4R vermittelt wurde (MACNEIL et al. 2002). Ab einer Konzentration von 100 nM α-MSH und höher war eine signifikante Zunahme gegenüber der basalen CRE-Aktivität festzustellen.

basal MSH HS024+MSH 0

1000 2000 3000 4000

CRE-Reporteraktivität [w. E.]

###

##

**

78

Abbildung 5.5: KWK der CRE-Reporteraktivität von α-MSH und γ-MSH in mHypoA-2/10-CRE-Zellen

Die Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen (1 pM bis 10 µM) α-MSH oder γ-MSH stimuliert. Die CRE-Reporteraktivität wurde in Abhängigkeit der Melanocortinkonzentration als Logarithmus aufgetragen. Dargestellt sind die Mittelwerte ± S.E.M. aus elf (α-MSH) und drei (γ–MSH) unabhängigen Experimenten. Für α-MSH wurde ein EC50 Wert von 5,6 nM ± 1,4 ermittelt, für γ–MSH von 10,5 µM ± 8,8. Signifikante Unterschiede im Vergleich zur niedrigsten Kon-zentration wurden mittels ANOVA und anschließendem Post-hoc-Test nach Dunnett ermittelt.

Die Inhibition der α-MSH-vermittelten cAMP-Akkumulation durch NPY wurde bereits in Abbildung 5.2 gezeigt. Um zu überprüfen, ob sich dieser antagonistische Effekt von NPY auf α-MSH auch auf die Ebene der CRE-Reporteraktivierung übertragen lässt, wurden mHy-poA-2/10-CRE-Zellen mit NPY vorinkubiert und anschließend mit α-MSH in Gegenwart von NPY stimuliert (Abbildung 5.6). Die α-MSH-vermittelte CRE-Reporteraktivität wurde durch NPY signifikant inhibiert.

Abbildung 5.6: Inhibition der α-MSH-vermittelten CRE-Reporteraktivität durch NPY

mHypoA-2/10-CRE-Zellen wurden für 10 min mit 100 nM NPY vorinkubiert und anschließend für 4 h mit 1 µM α-MSH in Gegenwart von NPY stimuliert. Es wurden die Mittelwerte aus drei unabhängigen Experimenten normiert und darge-stellt als x-fach + S.E.M über der basalen Aktivität. Die Prüfung der Werte auf signifikante Unterschiede erfolgte durch einen ungepaarten Student’s t-test.