5.12 Rolle der ERK-1/2 bei der α-MSH-vermittelten CREB/CRE-Aktivierung
5.12.6 Abhängigkeit der α-MSH-vermittelten CRE-Reporteraktivierung von ERK-1/2
Aufgrund der zentralen Funktion von ERK-1/2 als regulierende Kinasen der CREB-Phos-phorylierung von α-MSH, 5-HT und den Wachstumsfaktoren, wurde analysiert, ob sich diese Rolle von ERK-1/2 bei der α-MSH-induzierten CRE-Reporteraktivierung widergespie-gelt. Dafür wurde die CRE-Reporteraktivität in mHypoA-2/10-CRE-Zellen nach Vorinku-bation mit PD184352 und anschließender Stimulation mit α-MSH gemessen (Abbildung 5.44). Die CRE-Reportermessungen zeigten zunächst, dass sich die Reporteraktivität der sti-mulierten Zellen signifikant von der Lösungsmittel- bzw. Inhibitorkontrolle unterschieden.
In Gegenwart der Lösungsmittelkontrolle erhöhte sich die α-MSH-vermittelte CRE-Reporteraktivität vom Wert 1455 ± 77 auf 16374 ± 1151, in Anwesenheit von PD184352 stieg die Reporteraktivität nach Stimulation mit α-MSH von 1166 ± 158 auf 5948 ± 675 an. Das α-MSH-induzierte CRE-Signal wurde durch den MEK-Inhibitor von 16374 ± 1151 auf 5948
± 675 hochsignifikant inhibiert.
116
Abbildung 5.44: Inhibition der α-MSH-induzierten CRE-Reporteraktivierung durch den ERK-1/2-Inhibitor PD184352
mHypoA-2/10-CRE-Zellen wurden mit 10 µM PD184352 vorinkubiert und anschließend mit 1 µM α-MSH stimuliert.
Dargestellt ist die Summe der Daten aus zehn unabhängigen Experimenten als Mittelwert + S.E.M. Die Prüfung der Mit-telwerte auf signifikante Unterschiede erfolgte durch einen ungepaarten Student’s t-test.
Zur Feststellung, ob es sich um einen zelltypspezifischen Effekt handelte, dass die α-MSH-vermittelte CRE-Reporteraktivierung ERK-1/2-abhängig war, wurde der gleiche Versuchs-ansatz mit HEK-293-MC4R-Zellen durchgeführt. Vergleichbar mit den mHypoA-2/10-CRE-Zellen war auch in den HEK-293-MC4R-Zellen die durch den Liganden α-MSH-indu-zierte CRE-Reporteraktivität gegenüber der jeweiligen basalen Bedingung signifikant erhöht (Abbildung 5.45). Durch die Inhibition der ERK-1/2 durch PD184352 wurde das α-MSH-induzierte Signal signifikant von 33617 ± 2596 auf 14631 ± 2029 reduziert.
Abbildung 5.45: Inhibition der α-MSH-induzierten CRE-Reporteraktivierung durch den ERK-1/2-Inhibitor PD184352 in HEK-293-MC4R-Zellen
HEK-293-MC4R-Zellen wurden mit 10 µM PD184352 vorinkubiert und anschließend mit 1 µM α-MSH stimuliert. Darge-stellt ist die Summe der Daten aus fünf unabhängigen Experimenten als Mittelwert + S.E.M. Die Prüfung der Mittelwerte auf signifikante Unterschiede erfolgte durch einen ungepaarten Student’s t-test.
Die Quantifizierung der erhobenen Daten aus beiden Zelllinien (Abbildung 5.44 und Abbil-dung 5.45) ergab eine signifikante Inhibition des α-MSH-induzierten CRE-Signals durch PD184352 von 50 ± 8 % in mHypoA-2/10-CRE-Zellen und von 68 ± 5 % in
HEK-293-0 5000 10000 15000 20000
CRE-Reporteraktivität [w. E.]
basal α-MSH
0.1%
DMSO
PD18 4352
*** ***
***
0 10000 20000 30000 40000
CRE-Reporteraktivität [w. E.]
basal α-MSH
0.1%
DMSO
PD18 4352
*** ***
***
117 MC4R-Zellen (Abbildung 5.46). In beiden Zelllinien war die MC4R-vermittelte CRE-Reporteraktivierung von den Kinasen ERK-1/2 abhängig.
Abbildung 5.46: Inhibition der α-MSH-induzierten CRE-Reporteraktivierung durch den ERK-1/2-Inhibitor PD184352 in mHypoA-2/10-CRE und HEK-293-MC4R-Zellen
mHypoA-2/10-CRE- und HEK-293-MC4R-Zellen wurden mit 10 µM PD184352 vorinkubiert und mit 1 µM α-MSH sti-muliert. Dargestellt ist die prozentuale Inhibition der α-MSH-vermittelten CRE-Reporteraktivierung + S.E.M. aus zehn (mHypoA-2/10-CRE) und fünf (HEK-293-MC4R) unabhängigen Experimenten. Die Prüfung der Werte auf signifikante Unterschiede erfolgte mittels Einstichproben-t-Test.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten die ERK-1/2 als diejenigen Kinasen identifi-ziert werden, die als Verbindung zwischen EPAC und CREB sowie zwischen EPAC und CRE in der α-MSH-induzierten Signalkaskade fungierten.
5.13 Abhängigkeit der α-MSH-vermittelten CRE-Reporteraktivierung von Rap1A
Die GTPase Rap1 gilt als Substrat von EPAC und wird durch den Austausch von GDP gegen GTP aktiviert (DE ROOIJ et al. 1998; KAWASAKI et al. 1998). Durch die Verwendung des Rap1A-Inhibitors GGTI-298 (MCGUIRE et al. 1996) wurde analysiert, ob Rap1A in mHy-poA-2/10-CRE-Zellen durch α-MSH aktiviert werden konnte und in diese Signalkaskade in-volviert war. Das α-MSH-induzierte CRE-Signal war gegenüber der jeweiligen basalen Re-porteraktivität (Lösungsmittelkontrolle oder GGTI-298) signifikant erhöht. Die Inhibition von Rap1A durch GGTI-298 führte zu einer signifikant verminderten Signalstärke von α-MSH in mHypoA-2/10-CRE-Zellen. Das Signal wurde von 15066 ± 2592 auf 6269 ± 833 vermindert.
0 20 40 60 80 100
PD184352-induzierte Inhibition derα-MSH-vermittelten CRE-Aktivierung [%]
***
***
mHypoA-2/10-CRE
HEK-293-MC4R
118
Abbildung 5.47: Inhibition der α-MSH-induzierten CRE-Reporteraktivierung durch den Rap1A-Inhibitor GGTI-298 in mHypoA-2/10-CRE-Zellen
mHypoA-2/10-CRE-Zellen wurden für 48 h mit 10 µM GGTI-298 vorinkubiert und anschließend mit 1 µM α-MSH stimu-liert. Dargestellt ist die Summe der Daten aus sechs unabhängigen Experimenten als Mittelwert + S.E.M. Die Prüfung der Mittelwerte auf signifikante Unterschiede erfolgte durch einen ungepaarten Student’s t-test.
Die Inhibition von Rap1A resultierte auch in HEK-293-MC4R-Zellen in vergleichbaren Er-gebnissen. Die α-MSH-induzierte Reporteraktivität war in den HEK-293-MC4R-Zellen un-abhängig von der jeweiligen Vorinkubation mit DMSO oder GGTI-298 gegenüber der ba-salen Kontrolle signifikant erhöht (Abbildung 5.48). Das α-MSH-vermittelte Signal wurde durch GGTI-298 von 17823 ± 1761 auf 8394 ± 1385 signifikant inhibiert.
Abbildung 5.48: Inhibition der α-MSH-induzierten CRE-Reporteraktivierung durch den Rap1A-Inhibitor GGTI-298 in HEK-293-MC4R-Zellen
HEK-293-MC4R-Zellen wurden für 48 h mit 10 µM GGTI-298 vorinkubiert und anschließend mit 1 µM α-MSH stimuliert.
Dargestellt ist die Summe der Daten aus drei unabhängigen Experimenten als Mittelwert + S.E.M. Die Prüfung der Mittel-werte auf signifikante Unterschiede erfolgte durch einen ungepaarten Student’s t-test.
In beiden Zelllinien resultierte die Inhibition von Rap1A durch GGTI-298 in einer signifi-kanten Inhibition des α-MSH-vermittelten CRE-Signals. Die Quantifizierung der Reporter-messungen zeigt, dass das Signal durch GGTI-298 in mHypoA-2/10-CRE-Zellen um 74 ± 10
% und in HEK-MC4R-Zellen um 61 ± 10 % reduziert wurde (Abbildung 5.49). Aus diesen
0 5000 10000 15000 20000
CRE-Reporteraktivität [w. E.]
0.1 % DMSO
GGTI-298
*** basal
α-MSH
***
***
0 5000 10000 15000 20000
CRE-Reporteraktivität [w. E.]
***
0.1 % DMSO
GGTI-298
***
basal α-MSH
***
119 Ergebnissen hätte man darauf schließen können, dass in beiden untersuchten Zelllinien die α-MSH-vermittelte CRE-Reporteraktivierung Rap1A-abhängig war.
Abbildung 5.49: Inhibition der α-MSH-induzierten CRE-Reporteraktivierung durch den Rap1A Inhibitor GGTI-298 in mHypoA-2/10-CRE- und HEK-293-MC4R-Zellen
mHypoA-2/10-CRE- und HEK-293-MC4R-Zellen wurden mit 10 µM GGTI-298 vorinkubiert und mit 1 µM α-MSH sti-muliert. Dargestellt ist die prozentuale Inhibition der α-MSH-vermittelten CRE-Reporteraktivierung + S.E.M. aus mindes-tens sechs (mHypoA-2/10-CRE) und drei (HEK-293-MC4R) unabhängigen Experimenten. Die Prüfung der Werte auf sig-nifikante Unterschiede erfolgte mittels Einstichproben-t-Test.
Die erhobenen Daten mit dem Rap1A-Inhibitor sind jedoch mit Vorsicht zu betrachten (Abbildung 5.47 bis Abbildung 5.49). Anhand eines Beispiels wird deutlich, dass GGTI-298 nicht nur die α-MSH-vermittelte CRE-Reporteraktivierung inhibierte, sondern auch das Signal, welches durch Serum induziert wurde (Abbildung 5.50). Da die Serum-induzierte CRE-Reporteraktivierung zum Nachweis der spezifischen Wirkung von ESI-09 und HJC0197 (Abbildung 5.30) verwendet wurde und beide EPAC-Inhibitoren keinen Einfluss auf das Signal hatten, ließ sich für GGTI-298 nicht ausschließen, dass die Inhibition der CRE-Reporteraktivität auf unspezifischen Effekten beruhte.
Abbildung 5.50: Repräsentatives Beispiel für die GGTI-298 vermittelte Inhibition der α-MSH- und Serum-induzierten CRE-Reporteraktivität in mHypoA-2/10-CRE-Zellen
Zellen wurden mit 10 µM GGTI-298 vorinkubiert und anschließend mit 1 µM α-MSH oder 20 % Serum stimuliert.
0 20 40 60 80 100
GGTI-298-induzierte Inhibition derα-MSH-vermittelten CRE-Aktivierung [%]
***
*
mHypoA-2/10-CRE
HEK-293-MC4R
0 2500 5000 7500 10000 12500 15000 17500
CRE-Reporteraktivität [w. E.]
0.1 % DMSO GGTI-298
basal α-MSH Serum
120 Neben der Verwendung chemischer Inhibitoren können Zielstrukturen durch die Transfek-tion von Zellen mit spezifischen siRNAs inhibiert werden (MEISTER UND TUSCHL 2004). Da-her wurden mHypoA-2/10-CRE-Zellen mittels Elektroporation mit Rap1A- bzw. Kontroll-siRNA (Ctrl) transfiziert, um Effekte von Rap1A auf die α-MSH- und Serum-vermittelte CRE-Reporteraktivität zu untersuchen. In einem repräsentativ abgebildeten Western Blot ist der Einfluss der siRNA auf die Proteinexpression von Rap1A sichtbar (Abbildung 5.51A).
Die optische und densitometrische Auswertung zeigten eine Abnahme der Rap1A-Protein-expression um etwa 20 % nach der Transfektion mit Rap1A-siRNA im Vergleich zur Kon-troll-siRNA. Trotz Variation der Transfektionsmethode durch Veränderung der transfizier-ten siRNA-Menge, Zellzahl, Anzahl der Pulse und Pulsstärke konnte die Knock-Down-Effi-zienz nicht erhöht werden. Mit Rap1A- bzw. Kontroll-siRNA transfizierte Zellen wurden mit α-MSH oder Serum stimuliert und die CRE-Reporteraktivität wurde gemessen. Es wurde die prozentuale Inhibition der CRE-Reporteraktivität der mit Rap1A-siRNA transfizierten Zellen im Vergleich zu den mit Kontroll-siRNA transfizierten Zellen berechnet (Abbildung 5.51B). Die α-MSH-induzierte Reporteraktivität wurde signifikant um 25 ± 6 % reduziert, das Serum-vermittelte Signal um 8 ± 6 %. Die prozentualen Inhibitionen von α-MSH und Serum unterschieden sich signifikant voneinander.
Abbildung 5.51: Effekte von siRNA gegen Rap1A auf die α-MSH- und Serum-induzierte CRE-Reporteraktivität in mHypoA-2/10-CRE-Zellen
Zellen wurden mit 50 nM siRNA gegen Rap1A- oder mit Kontroll-siRNA (Ctrl) elektroporiert.
(A) Repräsentativer Rap1A-Proteinnachweis mittels Western Blot mit der Proteinbande von Rap1A (oben) und der Lade-kontrolle Tubulin (unten).
(B) Durch Rap1A-siRNA-induzierte Inhibition der α-MSH- und Serum-vermittelten CRE-Reporteraktivität, dargestellt als Mittelwert + S.E.M. aus vier unabhängigen Experimenten. Signifikante Unterschiede wurden mittels Einstichproben-t-Test (#) ermittelt, beim Vergleich zweier Bedingungen wurde ein ungepaarter Student’s t-test (*) angewandt.
121 Die Reduktion der Rap1A-Proteinexpression durch siRNA um etwa 20 % (Abbildung 5.51A) spiegelte sich in einer Abnahme der α-MSH-induzierten CRE-Reporteraktivität von etwa 25
% wider (Abbildung 5.51B). Die Daten in Abbildung 5.51 sprachen dafür, dass Rap1A in die α-MSH-vermittelte CRE-Reporteraktivierung involviert war, während die Serum-vermit-telte CRE-Reporteraktivierung Rap1A-unabhängig war.
5.14 Bedeutung von PKA und EPAC für die α-MSH-induzierte Genexpression in mHypoA-2/10-CRE-Zellen
Zur Einschätzung der physiologischen Relevanz der neu entschlüsselten MC4R-vermittelten CREB/CRE-Signalkaskade war ein weiterer Aspekt dieser Arbeit die Rolle von PKA und EPAC bei der Genexpression in hypothalamischen Zellen zu klären. Zur Untersuchung wur-den zwei CREB-abhängige Gene ausgewählt, welche eine CRE-Sequenz in ihrem Promoter besitzen und für die bereits gezeigt wurde, dass ihre Expression durch MC4R induziert wird.
Einerseits wurde der Fokus auf das Protoonkogen c-Fos gerichtet, andererseits auf das phy-siologisch relevantere TRH (BERKOWITZ et al. 1989; FISCH et al. 1989; HARRIS et al. 2001;
SARKAR et al. 2002; RAMIREZ et al. 2015). Mittels spezifischer Primer für c-Fos, TRH und das Haushaltsgen Aktin wurde via qPCR die α-MSH-induzierte Genexpression in mHypoA-2/10-CRE-Zellen analysiert.