7. Diskussion
7.3 Extraktion der Allergene aus den Lebensmittelmatrices
Die anschließende Dotierung der Schokolademasse mit dem Erdnuss-Standard war dann relativ einfach durchzuführen. Schokoladenmasse und Erdnussbutter schmolzen nämlich bei hohen Temperaturen. Damit konnte die Erdnussbutter mit Hilfe eines Handrührers bei 60 ᵒ C bei 2 h Rührzeit homogen in die Schokoladenmasse eingerührt werden.
Die so gewonnenen, mit Allergenen homogen dotierten Proben, wurden dann mit der Blindwertprobe in unterschiedlichen Verhältnissen in das von Deckwart (2009) und Steinhoff (2011) beschriebene Reaktionsröhrchen eingewogen. Damit waren die Allergene in verschiedenen Konzentrationen in den Proben enthalten.
Liu et al. (2013) berichtet. Eine Denaturierung des Caseins fand bei diesem pH-Wert nicht statt. Bei diesem pH-Wert konnte die Casein-Bestimmung mit dem ELISA durchgeführt werden.
Zur Extraktion der Erdnussproteine aus der Schokoladenmatrix wurden die gleichen in der Literatur beschriebenen Puffer getestet, die auch schon zur Extraktion von Casein aus dem Casein-Teig und den Muffins eingesetzt wurden. Aus den rohen Erdnüssen konnte das gesamte Protein bereits mit dest. Wasser extrahiert werden. Die Löslichkeit der Erdnussproteine nahm jedoch nach Erhitzung stark ab, dies wurde auch in der Literatur berichtet (Poms et al., 2004c). Die weitere Optimierung der Extraktion der Erdnussproteine aus der Schokoladenmatrix wurde daher mit gerösteten Erdnüssen durchgeführt. In diesem Beispiel konnte die Proteinbestimmung mit der Lowry-Methode durchgeführt werden, da keine Matrices enthalten waren. Es musste daher nicht darauf geachtet werden, eine Extraktionsmethode zu entwickeln, die zu keiner Konformationsänderung der Proteine führt.
Daher verwunderte das Ergebnis nicht, dass mit der Lowry-Methode fast 100 % der Erdnussproteine bestimmt werden konnten, mit dem ELISA war die Wiederfindung der Erdnussproteine jedoch niedrig. Die besten Extraktionspuffer enthielten stets SDS oder Harnstoff im basischen Bereich. Die Extraktion erfolgte daher bei pH 12,0 und die Proteinbestimmung nach der Lowry-Methode. Der ELISA konnte nicht angewendet werden, da entweder der verwendete Puffer nicht ELISA-tauglich war oder die Proteine bei der Extraktion denaturiert wurden.
7.3.2 Zusätze zum Extraktionspuffer
Es wurde versucht, die Extraktion des Caseins aus dem Casein-Teig und den Muffins durch Zugabe von Salz, Detergentien, Hühnereieiklar, Reduktionsmitteln und chaotropen Verbindungen zum Phosphatpuffer zu optimieren. Der optimale Zusatz war die Zugabe von 3 M Harnstoff zum Extraktionspuffer. Harnstoff löst nicht-kovalente Bindungen der Proteine an die Lebensmittelmatrix, denaturiert aber damit auch Proteine. Im Endeffekt wurden aber durch diese Freisetzung die Proteine aus der Lebensmittelmatrix besser extrahierbar. Durch Entfernen des Harnstoffs nach der Extraktion renaturierten die Proteine wieder. Die Harnstoffzugabe zum Extraktionspuffer hatte aber noch einen weiteren Vorteil, schon
geringe Mengen an Harnstoff verhinderten die Polymerisierung der Proteine. Dies wurde bereits von Orsini und Goldberg (1978) berichtet.
Die Zugabe von Harnstoff zum Extraktionspuffer erhöhte die Protein-Wiederfindung auch bei den gerösteten Erdnüssen aus der Schokoladen-Matrix. Das Erdnussprotein konnte allerdings nicht mit dem ELISA bestimmt werden, da das zugesetzte SDS und der Harnstoff die Proteinbestimmung störten (Bata et al., 1964; Anderson et al., 2009).
7.3.3 Aufreinigungsmethoden
Da sowohl das Casein als auch das Erdnussprotein nach der Extraktion mit SDS- und harnstoffhaltigen Extraktionsmitteln zwar gut extrahierbar waren, aber die Bestimmung mittels ELISA wegen dessen Störanfälligkeit durch die Gegenwart dieser beiden Zusätze scheiterte, sollten die extrahierten Proteine einer Aufarbeitung unterzogen werden. Ziel dieser Aufarbeitung war, die störenden Zusätze vollständig zu entfernen bzw. die Denaturierung der Proteine rückgängig zu machen, damit die Proteine mit dem ELISA bestimmt werden konnten. Es wurden folgende Verfahren geprüft: Dialyse, Ultrafiltration, Präzipitation und elektrophoretische Dialyse. In der Literatur liegen zu dieser Fragestellung bisher keine Ergebnisse vor.
Mit der Ultrafiltration, die problemlos durchgeführt werden konnte, konnten jedoch keine positiven Ergebnisse erzielt werden. Der Grund könnte sein, dass die Proteine sich unspezifisch an die Dialysemembran binden (Huisman et al., 2000). Die Methode konnte durch Blockierung der Oberfläche und Nachspülen nicht verbessert werden.
Es wurde die unspezifische Protein-Präzipitation mit einer Ammoniumsulfat-Lösung und die spezifische Präzipitation beim IEP durchgeführt. Mit der Präzipitation des Caseins am IEP gelang die Aufreinigung des Caseins am besten. Dabei fällt zwar das Casein aus, aber die Konfiguration wurde nicht irreversibel verändert. Die Renaturierung konnte daher durch die Einstellung des pH-Wertes mit neutralem PBS-Tween20-Puffer leicht durchgeführt werden.
Ein weiterer Vorteil der spezifischen IEP-Fällung war, dass wenig Protein aus der Lebensmittelmatrix ausgefällt wurde, so dass die Casein-Bestimmung mittels ELISA damit kaum gestört wurde.
Zusätzlich wurde eine Dialysemethode für die Aufreinigung des Caseins entwickelt. Da Casein an der Dialysemembran adsorbieren konnte (Blumenkrantz et al., 1981), wurde die Oberfläche der Dialysemembran auf 3 cm2 verkleinert und mit Weizenmehlextrakt blockiert.
Die Wiederfindung des Proteins war bei der Dialyse und der Präzipitation vergleichbar gut.
Die Präzipitation bot jedoch gegenüber der Dialyse hinsichtlich des Zeitaufwandes und der Anzahl der durchzuführenden Einzelschritte Vorteile. Daher wurde das Verfahren der Präzipitation angewendet.
Bei der Aufreinigung der Erdnussproteine gab es jedoch ein zusätzliches Problem, diese Proteine haben durchweg unterschiedliche IEP’s. Eine Präzipitation an einem bestimmten IEP war somit nicht möglich. Daher wurde versucht, an Stelle der IEP-Fällung die Dialyse-Methode anzuwenden. Es wurde also versucht, das im Erdnussextrakt vorhandene SDS, das den ELISA empfindlich störte, mittels Dialyse zu entfernen. Leider konnte SDS aus dem Erdnussextrakt nicht vollständig entfernt werden. Daher wurde die elektrophoretische Dialyse eingesetzt, damit die negativ geladenen SDS-Ionen im elektrischen Feld zur Anode wandern sollten. Allerdings blieb offensichtlich ein Teil des SDS an die Proteine gebunden, so dass auch diese Aufreinigungsmethode nicht zum erwünschten Ergebnis beim Erdnussprotein führte.
7.4 Methodenentwicklung und Methodenvalidierung