Enzymatischer Verdau der Matrices

6.2.10.3 Einsatz eines Ultraschallbades

Die Proben wurden nach dem Mahlen in einer Kugelmühle für 20 min in ein Ultraschallbad gegeben. Eine Vergleichsprobe ohne Behandlung im Ultraschallbad wurde ebenfalls untersucht. Um eine Temperaturerhöhung im Ultraschallbad zu vermeiden, wurde Eis in das Ultraschallbad gegeben. Die hier nicht weiter erwähnten Aufarbeitungsschritte wurden wie im Anhang 8.10.3 beschrieben, durchgeführt. Die Versuche wurden jeweils dreimal wiederholt. Die Mittelwerte und die Standardabweichungen der Wiederfindungen sind in Abbildung 40 dargestellt.

Abbildung 40: Wiederfindung des Caseins aus Casein-Teig mit und ohne Ultraschallbad-Behandlung (X-Achse: mit und ohne Ultraschallbad-Ultraschallbad-Behandlung; Y-Achse: Wiederfindung bezogen auf den Casein-Gehalt in den Casein-Teigen; Einzelwerte siehe Tabelle 50 im Anhang 8.16)

Aus Abbildung 40 folgt, dass die Wiederfindungen durch Behandlung der Proben im Ultraschallbad signifikant erhöht wurden. Bei den weiteren Versuchen wurde daher eine Behandlung der Proben im Ultraschallbad vorgeschaltet.

freigesetzt werden, da es weder chemisch an die Matrix gebunden noch physikalisch in den Matrices eingeschlossen war. Leider war aber die Wiederfindung nach dem Backen wegen der verschiedenen chemischen und physikalischen Reaktionen sehr niedrig. Vermutlich reagierten die nicht extrahierbaren Proteine teilweise mit Fetten und Kohlenhydraten der Matrices zu Lipo- bzw. Glykoproteinen oder sie wurden mit nicht-kovalenten Bindungen an diese gebunden. Daher wurde versucht, die Extrahierbarkeit der Proteine durch Verdau mit Lipase und Amylasen zu verbessern.

Die angewandten Methoden sowie die Zusammensetzung der Lösungen sind im Detail im Anhang 8.11 beschrieben.

6.2.11.1 Verdau mit Amylasen und Lipase

In diesem Versuch wurde 1 mL einer Casein Lösung (200 mg/kg) mit 0,1 mL den in Tabelle 7 beschriebenen 0,1%igen Enzymlösungen inkubiert. Die pH-Werte wurden mit Salzsäure auf die in Tabelle 7 angegebenen optimalen pH-Werte eingestellt. Die Reaktionen erfolgten über Nacht bei den in Tabelle 7 angegebenen optimalen Temperaturen. Die in der Tabelle 7 angegebenen pH-Werte und Temperaturen sind Herstellerangaben. Es konnte leider kein Casein nach Ende der Inkubation detektiert werden.

Tabelle 7: Optimale Bedingungen der verwendeten Enzyme

Enzym optimaler pH-Wert optimale Temperatur

Amylase aus Aspergillus niger 4,8 37 °C Amylase aus Schweinepankreas 6,9 53 °C Lipase aus Schweinepankreas 6,9 37 °C

Der Versuch wurde daher modifiziert. 20 µL Inkubationslösung wurden nach der in Tabelle 8 angegebenen Zeit aus dem Versuchsansatz entnommen und sofort mit dem Reduktionspuffer für die SDS-Page vermischt. Der Reduktionspuffer enthielt 2ME und SDS, welche die räumliche Struktur der Proteine zerstörten und somit auch die Enzyme inaktivierten. Die reduzierenden Lösungen wurden auf SDS-Page-Gele aufgetragen, nach Vorschrift im Abschnitt 8.3 elektrophoretisch getrennt und nach Vorschrift im Abschnitt 8.4 angefärbt. Die Gele sind in den Abbildung 41 und Abbildung 42 dargestellt und die

zugehörige Legende findet sich in Tabelle 8. Die Zusammensetzung des Proteinmarkers ist in Abbildung 73 im Anhang 8.3.2 beschrieben.

Abbildung 41: Exemplarisch SDS-Page-Gel für die Detektion des Caseins nach Verdau mit Amylase aus Aspergillus niger, in analoger Weise wurde ein SDS-Page-Gel für die Detektion des Caseins nach Verdau mit Lipase aus Schweinepankreas erstellt

Abbildung 42: SDS-Page-Gel für die Detektion des Caseins nach Verdau mit Amylase aus Schweinepankreas

Tabelle 8: Legende für die Verdaue mit Amylasen und Lipase

Nr. Substanz Nr. Substanz

1 Casein 6 Verdauprodukt nach 60 min

2 entsprechendes Enzym 7 Verdauprodukt nach 120 min 3 Verdauprodukt nach 0 min 8 Verdauprodukt nach 180 min 4 Verdauprodukt nach 10 min 9 Verdauprodukt über Nacht 5 Verdauprodukt nach 30 min M Marker

Auch nach Modifikation der Verdau-Versuche konnte kein Casein nachgewiesen werden.

Casein wurde wahrscheinlich ebenfalls verdaut, so dass es elektrophoretisch nicht mehr nachgewiesen werden konnte. Da die eingesetzten Enzyme aus Tieren und Mikroorganismen offensichtlich mit Proteasen verunreinigt waren, wurde das Ziel, nur die Matrices zu verdauen und die Caseine nicht anzugreifen, nicht erreicht. Daher müssen die Proteasen vollständig entfernt werden. Es zeigte sich, dass die Lipase und die Amylase aus Aspergillus niger hohe Protease-Aktivitäten aufwiesen, die Casein meist schon nach 10 Minuten abbauten. Außerdem beträgt der optimale pH-Wert für die Amylase aus Aspergillus niger 4,8 und ist somit fast gleich dem IEP von Casein (pH 4,6). Da Casein am IEP schlecht löslich ist, war die Amylase nicht für diesen Versuch geeignet.

Der Abbau des Caseins war mit der Amylase aus Schweinepankreas weniger intensiv im Vergleich zu den beiden Enzymen aus Aspergillus niger. Daher wurde die Amylase aus Schweinepankreas als Modellenzym für die weitere Aufreinigung gewählt, um damit die proteolytischen Enzyme zu entfernen.

Klassische Aufreinigungsmethoden sind Gelfiltration, präparative HPLC und weitere Methoden. In dieser Arbeit wurde jedoch eine relativ einfache Methode verwendet, die Stärke-Affinitäts-Aufreinigung. Mit dieser Methode wurde die Amylase aus Schweinepankreas aufgereinigt.

6.2.11.2 Aufreinigung der Amylase aus Schweinepankreas mittels Stärke-Affinitäts-Aufreinigung

Die Substrate werden beim enzymatischen Abbau zuerst spezifisch im aktiven Zentrum des Enzyms als Enzym-Substrat-Komplex gebunden. Das Enzym ermöglicht die Umwandlung des Substrats in die Reaktionsprodukte bei niedriger Aktivierungsenergie. Die Reaktionsprodukte werden anschließend aus dem Komplex frei gesetzt. Bei einer tiefen Temperatur könnte zwar das Enzym an das Substrat binden, die Aktivierungsenergie wird jedoch nicht erreicht, so dass keine Umsetzung des Substrats erfolgt. Somit kann man diese Eigenschaft nutzen, um die Amylase von anderen begleitenden Proteinen abzutrennen. Durch Erwärmen wurde die Amylase aktiviert und kann dann die Stärke abbauen. Die Produkte der Amylasereaktion können anschließend extrahiert werden. (Lizotte et al., 1990; Shaw et al., 1995; Najafi et al., 2005a und 2005b).

Damit die Aktivität der Amylase bei dieser Behandlung nicht abnimmt, wurden die Versuche in einem 0,03 M Phosphat-Puffer, der auf pH 6,9 eingestellt wurde, durchgeführt. Mit diesem Puffer konnte die Situation im Dünndarm des Schweines in vitro simuliert werden.

Der Puffer heißt demnach auch Darm-Simulations-Puffer (Lifshitz und Levitzki, 1976). Die genaue Zusammensetzung ist im Anhang 8.11.1 beschrieben.

Die folgenden Versuche wurden im Eisbad durchgeführt und alle verwendeten Lösungen wurden auf 4 °C abgekühlt. Die eingesetzte Stärke wurde zunächst mit dem 10-fachen Volumen des Darm-Simulations-Puffers gewaschen. Es wurden 0,2 g Amylase aus Schweinepankreas in 2 mL des Darm-Simulations-Puffers gelöst. Die fadenförmigen unlöslichen Bestandteile, die möglicherweise aus dem Pankreasgewebe stammten, wurden durch Zentrifugation entfernt. Nach mehreren Waschschritten mit dem Darm-Simulations-Puffer wurde die Suspension auf die vom Hersteller empfohlene optimale Temperatur von 53 °C im Wasserbad erwärmt und sofort zentrifugiert. Die klare Lösung wurde für die anschließenden Versuche aufbewahrt. Die genaue Versuchsdurchführung ist im Anhang 8.11.2 beschrieben.

Die Proteinkonzentration der Amylase ohne Aufreinigung und mit 2-6 Waschschritten wurde nach Lowry bestimmt. Um die Aktivität der Amylase zu bestimmen, wurde eine Zuckerbestimmung durchgeführt. Stärke besitzt theoretisch nur eine freie reduzierende Aldehydgruppe pro Molekül. Durch Zugabe von Amylase wird eine lange Stärkekette in mehrere kurze Ketten oder bis zu Maltose gespalten, wobei mehrere Aldehydgruppen freigesetzt werden. Damit kann die Amylase-Aktivität unter Verwendung von Maltose als Standard bestimmt werden. Eine Unit Amylase-Aktivität wird als die Menge Amylase definiert, die 1 µmol Maltose aus Stärke bei pH 6,9 und 53 °C freisetzt.

Die klassische Zuckerbestimmung nach Luff-Schoorl konnte nicht angewendet werden, da die anfallende Menge an Zucker nach dem Verdau zu gering war. Das Prinzip der Zuckerbestimmung in dieser Arbeit beruht auf der Reduktion des Cu(II) zu Cu(I) infolge der Anwesenheit des reduzierenden Endes der Maltose. Cu(I) reagiert weiter mit dem Folin-Ciocalteu-Reagenz entsprechend der Proteinbestimmung nach Lowry (siehe Abschnitt 5.2.6).

Die genaue Beschreibung der Versuche zur Amylase-Aktivitäts- und zur Zucker-Bestimmung ist im Anhang unter 8.11.3 und 8.11.4 dargestellt.

Die Amylase Aktivität wurde mit folgender Formel berechnet (Burrell, 1993; Copeland, 2000):

𝐔 = 𝐜 𝐌𝐰 × 𝐭

U: Aktivität der Amylase in der Lösung [Unit/mL]

c: Konzentration der Maltose in der Lösung [μg/mL]

Mw: Molekulargewicht der Maltose = 342,3 g/mol t: Inkubationszeit = 10 min

Eine weitere wichtige Kennzahl von Enzymen ist die spezifische Aktivität. Diese beschreibt den Anteil des entsprechenden Enzyms in einer Lösung, bezogen auf den gesamten Proteingehalt. Die spezifische Aktivität beschreibt somit die Reinheit eines Enzyms. Die spezifische Aktivität der Amylase wurde mit Hilfe folgender Formel ermittelt (Burrell, 1993;

Copeland, 2000):

𝐒𝐀 = 𝐔 × 𝐟 𝐏

SA: spezifische Aktivität der Amylase [Unit/mg]

U: Aktivität der Amylase in der Lösung [Unit/mL]

f: Verdünnungsfaktor, μg auf mg = 1000 P: Proteinkonzentration [μg/mL]

Der Proteingehalt, die Aktivität und die spezifische Aktivität der Amylase aus Schweinepankreas nach entsprechenden Waschschritte sind in Tabelle 9 dargestellt.

Die aus Schweinepankreas isolierte Amylase enthielt noch unerwünschte Begleitstoffe, z. B die beschriebenen fadenförmigen unlöslichen Stoffe, die bei der Lösung der Amylase im Darm-Simulations-Puffer auftraten. Die unlöslichen Stoffe wurden durch Zentrifugation entfernt, die löslichen Begleitstoffe wurden durch Stärke-Affinitäts-Aufreinigung entfernt.

Tabelle 9: Aktivität und Reinheit der Amylase aus Schweinepankreas nach 0 - 6 Wäschen Wäschen Proteingehalt [μg/mL] Aktivität [Unit/mL] Spezifische Aktivität [Unit/mg]

0 3247 2,92 0,90

2 481 2,20 4,57

3 410 1,72 4,19

4 307 1,03 3,36

5 234 0,67 2,86

6 186 0,37 1,98

Der Gesamtproteingehalt der Amylase-Lösung wurde nach 2 Waschschritten von 3247 µg/mL auf 481 µg/mL stark reduziert. In den Waschpuffern konnte keine Amylase-Aktivität mehr festgestellt werden, dennoch wurde die Aktivität der Lösung von 2,92 Unit/mL auf 2,20 Unit/mL abgesenkt. Es könnte sein, dass ein geringer Teil der Amylase ausgespült und durch mit gespülte Proteasen abgebaut wurde. Es konnte allerdings durch eine erhebliche Zunahme der spezifischen Amylase-Aktivität auch gezeigt werden, dass die Amylase fester und selektiver als die unerwünschten Proteine an die Stärke gebunden wurde. Nach weiteren Waschschritten wurden sowohl das Gesamtprotein als auch die Amylase-Aktivität reduziert. Das bedeutet, dass auch die Amylase durch intensives Waschen eluiert wurde.

100 μL der Amylase wurden ohne weitere Aufreinigung bzw. mit 2 - 6 Waschschritten mit 900 μL einer 1%igen Casein-Lösung vermischt und bei 53 °C für 1 h im Wasserbad inkubiert.

900 μL einer 1%igen Casein-Lösung wurden mit 100 μL Wasser vermischt und als Vergleich analog dem o.g. Versuch inkubiert. Die Inkubate wurden danach sofort abgekühlt, reduziert und zusammen mit dem Proteinmarker und dem Casein-Standard, also ohne Zugabe von Amylase und Erwärmung, mittels im Anhang unter 8.3 und 8.4 beschriebener SDS-Page- Methode aufgetrennt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 43 dargestellt.

Aus den Ergebnissen folgt, dass die Amylase aus Schweinepankreas zwar das Casein vor der Aufreinigung noch abbauen konnte, aber nach zwei Wäschen war keine Protease-Aktivität mehr vorhanden. Die meiste Protease wurde somit während der beiden ersten Wäschen entfernt, daher war die Abbauintensität des Caseins in den Kolonnen 3 - 6 mit der in Kolonne 2 vergleichbar. Kolonnen 7 und 8 zeigen, dass kein Casein während der Inkubation abgebaut wurde.

Abbildung 43: Verdau-Versuche der Amylase aus Schweinepankreas nach verschiedenen Waschschritten (1: Ohne Aufreinigung; 2: 2 Wäschen; 3: 3 Wäschen; 4: 4 Wäschen; 5: 5 Wäschen; 6: 6 Wäschen; 7: Casein ohne Zugabe von Amylase inkubiert; 8: Casein-Standard;

M: Proteinmarker)

Das Casein, das mit der aufgereinigten Amylase aus Schweinepankreas für 1 h inkubiert wurde, wurde mittels ELISA quantifiziert. Leider war die Extinktion niedrig, niedriger sogar als der Blindwert. Es wird daher vermutet, dass noch eine kleine Restmenge Protease in den Inkubaten vorhanden war. Neben dem Casein wurden die Antikörper, insbesondere die Einfang-Antikörper, während des ELISA abgebaut, daher wurde kein Casein detektiert. Um diese Vermutung zu bestätigen, wurde Casein über längere Zeit mit der Amylase aus Schweinepankreas inkubiert. Die 1%ige Casein-Lösung wurde mit der Amylase, die 2, 3, 4 und 6 Wäschen durchlief, über Nacht bei 53 °C im Wasserbad inkubiert. Drei Wiederholungen wurden mit der Casein-Lösung ohne Zugabe von Amylase durchgeführt. Die Inkubate wurden der SDS-Page zugeführt. Das Ergebnis ist in Abbildung 44 dargestellt.

Aus Abbildung 44 geht hervor, dass nach Aufreinigung der Amylase noch eine geringe Protease-Aktivität vorhanden war. Es wurde zwar kein Abbau des Caseins nach einstündiger Inkubation beobachtet, es konnte aber auch kein Casein nach der Inkubation über Nacht mehr detektiert werden.

Abbildung 44: Verdau-Versuch von Casein mit Amylase aus Schweinepankreas über Nacht (1:

Casein-Standard, 2: 2 Wäschen; 3: Wäschen; 4: 4 Wäschen; 5: 6 Wäschen; 6-8: Casein ohne Zugabe von Amylase inkubiert; 9: Casein-Standard; M: Proteinmarker)

In der Praxis werden Protease-Inhibitoren verwendet, um die Protease-Aktivitäten in biochemischen Versuchen zu reduzieren. In unseren Versuchen wurde Pefabloc SC(4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonyl-fluorid-hydrochlorid, Roche, Schweiz) eingesetzt. Entsprechend den Herstellerangaben wurde die Casein-Amylase-Mischung mit 3 mM versetzt. Die in diesem Versuch verwendete Amylase aus Schweinepankreas wurde dreimal gewaschen und die 1%ige Casein-Lösung im Verhältnis 1:10 zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde 3- 4,5 h im Wasserbad bei 53 °C inkubiert. Die Vergleichsuntersuchungen wurden ohne Zugabe von Pefabloc SC analog durchgeführt. Die Versuche wurden auch mit einer Casein-Lösung ohne Zugabe von Amylase und Pefabloc SC durchgeführt. Die Inkubate der Versuche wurden der SDS-Page zugeführt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 45 dargestellt.

Pefabloc SC verhindert, wie erwartet, die Protease-Aktivität in den Versuchsansätzen. Die Casein-Banden mit Pefabloc SC in Kolonne 6 waren nach 3 h Inkubation intensiver als diejenigen ohne Zugabe von Pefabloc SC in Kolonne 2. Nach 4,5 h Inkubation waren die Casein-Banden in Kolonne 9 noch gut sichtbar, während das Casein in Kolonne 5 ohne Zugabe von Pefabloc SC fast vollständig abgebaut wurde. Im Vergleich zu den Casein- Lösungen, die ohne Amylase und Pefabloc SC inkubiert wurden, konnte in der aufgereinigten Amylase noch eine Protease-Aktivität festgestellt werden.

Abbildung 45: Verdau-Versuche mit Pefabloc SC (1: Casein ohne Amylase und Pefabloc SC; 2-5: ohne Pefabloc SC; 6-9: mit Pefabloc SC; 2 und 6: für 3 h inkubiert; 3 und 7: für 3,5 h inkubiert; 4 und 8: für 4 h inkubiert; 5 und 9: für 4,5 h inkubiert)

Fasst man die Ergebnisse zusammen, dann muss man feststellen, dass die Idee des enzymatischen Verdaus nicht realisiert werden konnte, da die Begleitproteine bzw. die Protease-Aktivität nicht vollständig entfernt werden konnten.