1.4 D ISKUSSION
1.4.1 Expressionsstärke, Gewebsspezifität und Entwicklungsabhängigkeit des as-1-
ocs-Element
Ziel dieser Arbeit war es Mutanten zu erzeugen, die nach Induktion mit Salizylsäure das as-1-Element nicht mehr aktivieren können. Zur Konstruktion eines induzierbaren Sui-zidsystems wurde auf die Daten zurückgegriffen, die Zhang und Singh (1994) über das as-1-ähnliche Element veröffentlicht hatten. In dieser Studie wurde gezeigt, daß das ocs-Element eine geringe Grundexpression in Wurzeln vermittelt. Um überhaupt einen Expressi-onsnachweis mittels histochemischer Färbung führen zu können, mußten vier Kopien des ocs-Elements als Promotor vor dem β-Glucuronidasegen eingesetzt werden. Die Grundex-pression in den oberirdischen Organen befand sich mit diesem 4×ocs-Promotor an der Nachweisgrenze der quantitativen RT-PCR. In Wurzeln und oberirdischen Organen war das ocs-Element durch 50 µM Auxin um das 50 – 100-fache und mit Salizylsäure um das 10 – 20-fache induzierbar. Die Aktivierung der Transkription nach der Induktion mit Salizylsäure verlief transient. Mit dem –90-Fragment des 35S-Promotors, das ein as-1-Element enthält, konnte eine histochemische β-Glucuronidasefärbung ebenfalls nur nach Induktion mit Auxin festgestellt werden, wobei die Aktivität schwächer war als mit dem 4×ocs-Promotor. Weitere Daten mit dem –90-Fragment des 35S-Promotors wurden nicht gezeigt.
Anhand dieser Daten schien es möglich zu sein, ein induzierbares dominant negatives Selektionssystem mit dem as-1-Element zur Suche nach Mutanten zu konstruieren. Es wur-de daher das as-1-Element verwandt, um die Barnase als salizylsäureabhängiges Suizidgen einzusetzen. Dieser Ansatz erwies sich als Fehlschlag, da keine Transformanden des as-1-Barnasekonstrukts gewonnen werden konnten. Da bereits eine sehr geringe Expression der Barnase ausreicht, um toxisch zu wirken, war durch dieses Ergebnis bereits ein erster Hin-weis darauf gegeben, daß die Expressionsstärke des as-1-Elements größer war als zunächst vermutet wurde.
Die Charakterisierung der Transformanden mit der Deacetylase als weniger toxischem, konditionellem Selektionsmarker unter der Kontrolle eines einzelnen as-1-Elements zeigte, daß die Expressionsstärke nicht ausreichte, um die Pflanzen in einem nutzbaren Zeitraum absterben zu lassen. Ein langsames Absterben konnte nur erreicht werden, wenn die Pflan-zen auf 2MS-Agar angezogen wurden (Kapitel 1.3.2.2). Nachdem die mit Salizylsäure und NAcPT behandelten Pflanzen abgestorben waren, erwiesen sich die nur mit Salizylsäure induzierten Pflanzen als so geschwächt, daß sie den Transfer auf Erde nicht mehr überleb-ten. Pflanzen, die auf Erde angezogen worden waren, zeigten keine Anzeichen einer
Vergif-Teil 1: Diskussion 91
tung (Kapitel 1.3.3.5). Offensichtlich reichte hier die Aktivität des 1×as-1-Promotors nicht aus, um den Schwellenwert der Deacetylaseaktivität zu überschreiten, der für eine zum Erreichen toxischer Konzentrationen des Herbizids bei Umsetzung von N-Acetyl-Phosphinothricin nötig ist. Somit waren die 1×as-1-Gus-Deac-Linien für eine Suche nach Mutanten ungeeignet. An diesen Pflanzen wurde erstmals eine aufgrund der bekannten Daten von Zhang und Singh (1994) und den an Tabak durchgeführten Untersuchungen von Benfey und Chua (1990) un-erwartete Expressionsstärke und Gewebsspezifität festgestellt.
Beim Nachweis der β-Glucuronidase durch histochemische Färbung erstreckte sich die Expression auf das gesamte Wurzelsystem, und in stark exprimierenden Linien auf das Hy-pokotyl und die Blätter (Kapitel 1.3.2.3). Dabei war die Aktivität des as-1-Elements vor allem im Bereich der Leitgewebe im Hypokotyl und der Blattadern ausgeprägt. Auch war ein Gra-dient der as-1-Aktivität hinsichtlich des Alters der Blätter feststellbar: In alten Blättern war die Expression stärker als in jungen. Dieses Aktivitätsmuster in Arabidopsis thaliana wurde auch von Lubenow (1997) beobachtet, die statt der hier eingesetzten synthetischen as-1-β-Glucuronidasekonstrukte das –90-Fragment des 35S-Promotors des Blumenkohlmosaikvi-rus verwandte. Weitere Punkte hoher as-1-Aktivität befanden sich an den Vegetationspunk-ten der Rosette in der Umgebung des Meristems sowie an den Blatträndern im Bereich der feinen Randzähne. Lubenow (1997) identifizierte die letzteren Gewebe als Hydathoden, die morphologisch als Restmeristeme angesehen werden können. Besonders starke β-Glucuronidaseaktivitäten wurden auch in den Keimblättern beobachtet, die auf dem Agar aufgelegen hatten. Damit weicht die in dieser Arbeit beobachtete Gewebsspezifität von den Daten von J. Arias (persönliche Mitteilung) und Zhang und Singh (1994) ab. Als Erklärung der Diskrepanz zwischen den in dieser Arbeit präsentierten Daten und den Ergebnissen von Lubenow (1997) einerseits und den Ergebnissen von J. Arias (persönliche Mitteilung) und Zhang und Singh (1994) andererseits kommt vor allem das unterschiedliche Alter der Pflan-zen in Frage, in dem die histochemischen Färbungen durchgeführt wurden. Während die Pflanzen von Arias (persönliche Mitteilung) sowie von Zhang und Singh (1994) im Alter von einer Woche untersucht wurden, waren die in dieser Arbeit und von Lubenow (1997) gefärb-ten Pflanzen zwei bis drei Wochen alt. Sowohl in dieser Arbeit als auch bei Lubenow (1997) wurde festgestellt, daß die vom as-1-Element gesteuerte Expression vor allem in älteren Blättern stark, in jungen Blättern jedoch kaum feststellbar ist
Um eine stärkere Expression der Deacetylase und einen besser nutzbaren Suizidphä-notyp zu erhalten, wurden fünf as-1-Elemente als Promotor vor dem Deacetylasegen ver-wandt. Wie zu erwarten war, zeigte der 5×as-1-Promotor eine stärkere Aktivität als ein ein-zelnes as-1-Element. Im Vergleich zu dem von Zhang und Singh (1994) beschriebenen 4×ocs-Promotor war der 5×as-1-Promotor jedoch unerwartet stark. Dies äußerte sich im konstitutiven Suizidphänotyp ebenso wie an der Intensität der histochemischen
β-Glucuroni-Teil 1: Diskussion 92
dasefärbung. Die Stärke des 5×as-1-Promotors brachte es mit sich, daß nach langer Inkuba-tion im histochemischen Färbebad alle Gewebe gefärbt wurden, sodaß das as-1-Element scheinbar auch eine Transkriptionsaktivität im parenchymatischen Gewebe und den Epider-miszellen vermittelt (Kapitel 1.3.3.2). Wurden die 5×as-1-GUS-Deac-Pflanzen auf Erde kulti-viert, war die Expression der Reportergene geringer als in Sterilkultur, sodaß die Ge-websspezifität bezüglich der Leitgewebe deutlich sichtbar wurde (Kapitel 1.3.3.2 und 1.3.3.21). Aufgrund dieser Ergebnisse konnte davon ausgegangen werden, daß keine durch die Klonierung entstandenen palindromischen oder wiederholten Sequenzen zwischen den as-1-Elementen zu unerwünschten Effekten führten.
Die im Vergleich zum 4×ocs-Promotor unerwartete Expressionsstärke des 5×as-1-Promotors ist nicht alleine mit dem Alter der Pflanzen, einer entwicklungsspezifischen Re-gulierung und dem einen zusätzlichen cis-Element erklärbar. Als weiterer Faktor muß die bessere Konservierung der Sequenz des as-1-Elements bezüglich der Konsensussequenz in Betracht gezogen werden ( ). Beim
as-1-Element weichen vier der 16 konservierten Basen von der palindromischen Konsensus-sequenz ab, beim ocs-Element sind es sechs abweichende Basen, sodaß nur die zwei ACGT-Kernmotive unverändert erhalten sind. Qin et al. (1994) berichteten, daß ein as-1-Element mit zwei perfekten Palindromen eine verstärkte Transkriptionsaktivierung bewirkt;
umgekehrt besaßen as-1-ähnliche Elemente, die der Konsenssequenz weniger entsprachen ein geringeres Aktivierungspotential (Lam et al., 1989; Qin et al., 1994). Basierend auf die-sen Ergebnisdie-sen muß davon ausgegangen werden, daß das weniger konservierte ocs-Element ebenfalls eine geringere Transkriptionsaktivierung vermittelt als das konserviertere as-1-Element.
Abbildung 47: Vergleich von as-1- und ocs-Element mit der Konsensussequenz zweier perfekter
Palin-drome
Bezüglich des Suizidphänotyps vermittelte der 5×as-1-Promotor in Sterilkultur eine so starke Expression, daß die Pflanzen im induzierten und im uninduzierten Zustand ohne sichtbaren Unterschied abstarben. Für Pflanzen in Erdkultur konnte für eine der untersuchten transgenen Linien lediglich ein Mal gezeigt werden, daß der gewünschte Phänotyp auftrat. In weiteren Versuchen konnte dieser Phänotyp nicht mehr wiederholt werden. Stattdessen trat in den uninduzierten Pflanzen eine graduell verlangsamte Schädigung des Gewebes ein.
Wurde nach einer Schädigung das Sprühen mit N-Acetyl-Phosphinothricin rechtzeitig einge-stellt, so erholten sich einige der Pflanzen wieder. Im Vergleich dazu war die Schädigung der induzierten Pflanzen so stark, daß sie sich nach Beendigung des Sprühens mit Salizylsäure
Teil 1: Diskussion 93
und N-Acetyl-Phosphinothricin nicht mehr erholten und abstarben. Diese Differenz war aus-reichend, um sie für die Suche nach Mutanten nutzbar zu machen.
Dennoch war der in dieser Arbeit verwandte 5×as-1-Promotor für einen Suizidansatz zur Suche nach Mutanten nicht optimal. Erstens war er durch einen relativ geringen onsfaktor gekennzeichnet. Für einen Suizidansatz wäre jedoch ein möglichst hoher Indukti-onsfaktor wünschenswert, um einen deutlicheren Unterschied zwischen Absterben im indu-zierten Zustand und Überleben im uninduindu-zierten Zustand zu erhalten. Zweitens vermittelte der 5×as-1-Promotor eine konstitutive Aktivität, die über dem Schwellenwert für eine Toxizität des dominant negativen Deacetylasesystems lag. Drittens war die Induktion des as-1-Elements durch Salizylsäure nur transient, sodaß in dem kurzen Zeitraum der gesteigerten Transkription möglicherweise keine großen Mengen an Deacetylase akkumuliert werden konnten; diesem Umstand konnte aber durch eine mehrfache Induktion entgegengewirkt werden. Diese Probleme im Zusammenspiel mit der geringen Induzierbarkeit zwangen zu einer differentiellen Strategie bei der Suche nach Mutanten (siehe Kapitel 1.3.3.13). Dabei wurden zwei Kontrollgruppen mit Wildtyppflanzen parallel zur mutagenisierten Population behandelt. Eine der Kontrollgruppen wurde nur mit N-Acetyl-Phosphinothricin besprüht, die andere mit Salizylsäure und N-Acetyl-Phosphinothricin. Sowie feststand, daß die Pflanzen der mit Salizylsäure induzierten Kontrollgruppe absterben würden, von den uninduzierten Kontrollpflanzen jedoch Überlebende verblieben, wurde das Sprühen aller Pflanzen einge-stellt. Dabei mußten jedoch zwei Nachteile in Kauf genommen werden: Erstens war die Stringenz — eigentlich ein großer Vorteil von Suizidsystemen — viel geringer, als sie bei einem deutlichen Unterschied zwischen uninduziertem und induziertem Zustand gewesen wäre. So mußte mit dem Überleben von falsch positiven Pflanzen gerechnet werden. Zwei-tens konnte nicht ausgeschlossen werden, daß Pflanzen, die aufgrund einer Mutation über-lebt hätten, dennoch abstarben, weil sie zufällig an einer besonders exponierten Stelle stan-den — beispielsweise am Rand eines Topfes — und intensiver mit der Suizidlösung in Kon-takt kamen. Auf diese Weise könnten auch Mutanten verloren gegangen sein. Für den Fall, daß die Stringenz bei der differentiellen Strategie zu gering war, wurde ein Teil der M2 -Generation mit der ursprünglich geplanten stringenten Strategie behandelt, bei der die Pflan-zen bis zum Austreiben der ersten Blütenknospen mit Salizylsäure und N-Acetyl-Phosphinothricin besprüht wurden.
Die Verwendung einer geringeren Anzahl, zum Beispiel zwei oder drei as-1-Elemente, ergäbe möglicherweise einen Promotor mit besseren Eigenschaften für die Suche nach Mut-anten mit der Deacetylase als dominant negativem Selektionsmarker. Umfangreichere Cha-rakterisierungen im Vorfeld der Mutagenese auch mit solchen Promotoren wären vorteilhaft gewesen. Künstliche Promotoren mit mehr als drei wiederholten cis-Elementen sollten auch nach anderweitigen Erfahrungen vermieden werden, da sie lediglich eine erhöhte
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grundaktivität, aber keine vorteilhaftere Induzierbarkeit aufweisen (Imre Somssich, persönli-che Mitteilung). Daß die Deacetylase im Einsatz als konditionelles, dominant negatives Se-lektionssystem auch hervorragende Unterschiede zwischen induziertem und induziertem Zustand markieren kann, zeigen die lediglich einmal erhaltenen Ergebnisse aus Kapitel 1.3.3.5.