Expressionsanalyse der 5GuDe-Linie #16-12 in Sterilkultur

Um die starken Schwankungen der Hintergrundaktivität, die bei der Anzucht auf Erde auftraten, und den unspezifischen Streß, der zur Verschiebung der PR-1-Induktion zu

uner-Teil 1: Ergebnisse 61

1000 0 2000 3000 4000 5000 6000 7000

0 1 2 3 6 21 24 27 30 0 1 2 3 6 21 24 27 30

spezifische β-Glucuronidaseaktivität

Wasser 1 mM SA

Stunden nach Induktion

wartet frühen Zeitpunkten der PR-1-Expression führte, zu vermeiden, wurden weitere Induk-tionsversuche in Sterilkultur durchgeführt.

Wie die zeigt, ist auch in diesem Versuch eine Hintergrundaktivität des 5×as-1-Promotors anhand der Expression der Deacetylase bereits im ununduzierten Zustand deutlich sichtbar. Dem Problem der starken Aktivitätsschwankungen des as-1-Elements konnte durch Sterilkultur ebenfalls nicht begegnet werden.

Abbildung 29

Abbildung 27: Zeitverlauf der spezifischen Aktivität β-Glucuronidase in Pflanzen der Linie 5GuDe #16-12 in Steril-kultur auf MS-Agar ohne Saccharose

F4-Samen der Linie 5GuDe #16-12 wurden auf MS-Agar ohne Saccharose ausgesät. Zwei Wochen nach der Keimung wurden die Pflanzen wie in Kapitel 1.2.22.3 beschrieben mit 1 mM Salizylsäure induziert und zu den angegebenen Zeit-punkten Proben genommen. Die spezifische Enzymaktivität der β-Glucuronidase wurde in Proteinextrakten dieser Proben wie in Kapitel 1.2.30 beschrieben getestet.

Der Anstieg der Expression der Deacetylase begann bereits 1 h nach Zugabe von Sa-lizylsäure und steigerte sich zu einem Maximum etwa 27 h nach der Induktion um den Faktor 6,5. Der Induktionsfaktor liegt damit im selben Bereich wie bei dem Versuch auf Erde (Kapi-tel 1.3.3.6). Das Expressionsniveau lag allerdings auf Agar generell höher als auf Erde, was die Quantifizierung, die bei geringen Transkriptmengen schwierig war, zuverlässiger machte.

Auch die Extraktion von RNA war bei Pflanzen, die auf Agar angezogen waren, effizienter als bei Pflanzen auf Erde. Wenn möglich wurden daher Induktionsversuche auf Agar durchge-führt.

Mit Proben derselben Pflanzen wurden Messungen der β-Glucuronidaseaktivität durchgeführt.

Wie in zahlreichen nicht dargestellten Versuchen unter verschiedenen Wachstumsbe-dingungen ist auch hier eine Erhöhung der β-Glucuronidaseaktivität nach Induktion mit Salizylsäure nicht feststellbar (Abbildung 27). Vielmehr verharrt die Enzymaktivität in allen 5GuDe-Linien auf sehr hohem Niveau. Die Bestimmung der Enzymaktivität hat sich damit als ungeeignet für die weitere Charakterisierung der Salizylsäureinduktion erwiesen. Dies schließt jedoch nicht aus, daß eine starke Verringerung der β-Glucuronidaseaktivität im Falle einer verminderten Induktion des as-1-Elements aufgrund einer Mutation in einem Versuch

Teil 1: Ergebnisse 62

28 S rRNA PR-1 Deac GUS 0 20 40 60 80

36 24 12 6 4

0 2

2 4 12 24 36

0 6

Deac PR1

Wasser 1 mM SA

relativeTranskriptmenge

Stunden nach Induktion

Abbildung 28: Zeitverlauf der Expression der Deacetylase, der β-Glucuronidase und von PR-1 in Pflanzen der Linie 5GuDe #16-12 in Sterilkultur auf MS-Agar ohne Saccharose

F4-Samen der Linie 5GuDe #16-12 wurden auf MS-Agar ohne Saccharose ausgesät. Zwei Wochen nach der Keimung wurden die Pflanzen wie in Kapitel 1.2.22.3 beschrieben mit 1 mM Salizylsäure induziert und zu den angegebenen Zeit-punkten Proben genommen. RNA-Extrakte dieser Proben wurden auf die Expression der Deacetylase, der β-Glucuronidase und von PR-1 getestet.

dieser Art repräsentiert werden kann. Daher kann die Bestimmung der β-Glucuronidaseaktivität von vermuteten Mutanten hilfreich für deren Identifikation sein.

Die Daten der Enzymaktivität stehen damit im Widerspruch zu der sehr wohl stattfin-denden Erhöhung der Transkriptmenge der β-Glucuronidase nach Induktion mit Salizylsäure.

Welche Ursachen für die offenbar nicht weiter zu erhöhenden β-Glucuronidasegehalte in Frage kommen, konnte in dieser Arbeit nicht weiter untersucht werden.

In einem weiteren Induktionsexperiment gelang es, die durch den 5×as-1-Promotor vermittelte frühe Antwort von der späten Antwort, repräsentiert durch PR-1, zu trennen.

Wie Abbildung 28 zeigt, war die Expression der beiden as-1-gesteuerten Reportergene Deacetylase und β-Glucuronidase bereits zwei Stunden nach der Induktion gesteigert, er-reichte ihr Maximum bei etwa 12 h und war dann etwa um den Faktor 6⅓ stärker als im un-induzierten Zustand. Danach sanken die Transkriptmengen ab und waren 36 h nach der In-duktion beinahe wieder auf die Anfangskonzentrationen zurückgegangen.

Teil 1: Ergebnisse 63

Deac

28 S rRNA

0 1 2 3 6 24 27 30 0 1 2 3 6 24 27 30

0 2000 4000 6000 8000

GUS

rel. Deac-Transkriptmenge

Wasser 1 mM SA

Stunden nach Induktion

Abbildung 29: Zeitverlauf der Expression der Deacetylase und der β-Glucuronidase in Pflanzen der Linie 5GuDe #16-12 in Sterilkultur auf MS-Agar ohne Saccharose

F4-Samen der Linie 5GuDe #16-12 wurden auf MS-Agar ohne Saccharose ausgesät. Zwei Wochen nach der Keimung wurden die Pflanzen wie in Kapitel 1.2.22.3 beschrieben mit 1 mM Salizylsäure induziert und zu den angegebenen Zeit-punkten Proben genommen. RNA-Extrakte dieser Proben wurden auf die Expression von Deacetylase und β-Glucuronidase getestet.

Die Expression von PR-1 wurde dagegen erst zwischen 12 h und 24 h nach der Induk-tion gesteigert. Zu den Zeitpunkten 24 h und 36 h wurden vergleichbare Transkriptmengen gemessen.

Damit ist in diesem Experiment die Trennung von früher und später Antwort gelungen.

Aufgrund dieser Ergebnisse wurden bei allen weiteren Induktionsversuchen auf Agar mit Salizylsäure zu den Zeitpunkten 0 h, 6 h und 24 h nach Zugabe von Salizylsäure Proben geerntet und ausgewertet.

Teil 1: Ergebnisse 64

Deac

400 µM BION 200 µM 2,4-D 46 µM MeJA

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

relative Deac-Transkriptmenge

Abbildung 30: Zeitverlauf der Expression der Deacetylase in Pflanzen der Linie 5GuDe #16-12 in Sterilkultur auf MS-Agar ohne Saccharose

F4-Samen der Linie 5GuDe #16-12 wurden auf MS-Agar ohne Saccharose ausgesät. Zwei Wochen nach der Keimung wurden die Pflanzen wie in Kapitel 1.2.22.3 beschrieben mit den angegebenen Lösungen induziert und zu den aufgeführten Zeitpunkten Proben genommen. RNA-Extrakte dieser Proben wurden auf die Expression der Deacetylase, der β-Glucuronidase und von PR-1 getestet.

Zur Charakterisierung weiterer Stimuli wurden Induktionen mit dem funktionellen Sali-zylsäureanalog BION, dem synthetischen Auxin 2,4-D und Methyljasmonat durchgeführt.

Damit sollten Daten gewonnen werden, die bei der späteren Charakterisierung von Mutanten herangezogen werden könnten.

In Abbildung 30 ist gezeigt, daß eine Induktion der Deacetylaseexpression nur durch 2,4-D zu erzielen war. Hierbei unterschied sich allerdings die Kinetik der Deacetylaseaktivie-rung von derjenigen bei Salizylsäureinduktion. Mit 2,4-D stieg die Expression bis 12 h nach der Induktion an. Danach blieb die Expression stabil und fiel nicht, wie bei Induktion mit Sali-zylsäure, wieder ab.