4. Diskussion
4.8 Bestimmung des relativen DNA-Spiralisierungsgrades
Der Spiralisierungsgrad der DNA ist ein wichtiger Faktor, der einen Einfluss auf die Expression einer Vielzahl von Genen hat [235, 236]. Der jeweils im Bakterium erforderliche Spiralisierungsgrad (zum Beispiel für die Replikation) wird in der Hauptsache durch die Funktion der Topoisomerase I und Topoisomerase II reguliert (vergleiche Kapitel 1.3.1).
Mehrere Möglichkeiten zur Messung der relativen Superspiralisierung stehen zur Verfügung.
Die Messung des Laufverhaltens der DNA in chloroquinhaltigen Gelen [171, 237], der Zusatz von Psoralenderivaten [238] oder die Verwendung von Reportergenkonstrukten [171]
ermöglichen eine Bestimmung. Die verschiedenen Methoden werden im Folgenden kurz vorgestellt und es wird der Grund genannt, warum ein anderes System verwendet wurde.
Unterschiedliche DNA-Topoisomere zeigen in chloroquinhaltigen Agarose-Gelen ein unterschiedliches Laufverhalten bei der Elektrophorese, da sich die Mobilität im Gel je nach Topologie verändert. Die Messung des Laufverhaltens der DNA in chloroquinhaltigen Gelen ist methodisch sehr aufwändig und schwer zu quantifizieren [171, 237]. Dieses System eignet sich vor allem dazu, tendenzielle Unterschiede des Spiralisierungsgrads (höher oder niedriger als eine Referenz) zu erkennen. In dieser Arbeit sollte der Spiralisierungsgrad
möglichst genau quantifiziert werden und auch geringe Änderungen sollten erfasst werden.
Diese Methode eignet sich somit nur bedingt für die hier zu beantwortende Fragestellung.
Bakterielle Zellen sind permeabel für Psoralenderivate. In der Zelle bindet Psoralen an DNA, RNA und Proteine. Die Bindung an superspiralisierte DNA ist höher als die Bindung an relaxierte DNA. Durch Bestrahlung der Zellen mit UV-Licht wird gebundenes Psoralen visualisiert. Die Permeabilität verschiedener Bakterienstämme für Psoralen ist sehr variabel [238]. Für einen Vergleich der Superspiralisierung verschiedener Stämme, so wie es das Ziel des Versuchs in dieser Arbeit war, ist diese Methode somit nicht geeignet.
Ein plasmidcodiertes Reportergenkonstrukt, in dem jeweils einer der Promotoren von topA beziehungsweise gyrA mit dem Luciferasegen fusionert war (ABUMRAHEIL et al [171]), basiert auf dem Phänomen der homöostatischen Kontrolle und diente als Ausgangspunkt für die Bestimmung der Superspiralisierung in dieser Arbeit (vergleiche Kapitel 3.8). Für diesen Luciferase-Assay muss jeder zu untersuchenden Stamm mit beiden Plasmide getrennt voneinander transformiert werden. Die so erhaltenen Zellen werden dann inkubiert, geerntet und lysiert. Gemessen wird anschließend die Lichtintensität bei 560 nm. Diese Methode wurde in dieser Arbeit nicht verwendet, da die Messung auf Translations-Ebene erfolgt. Da eine Korrelation mit der dnaQ-Expression, die mittels qRT-PCR auf Transkriptionsebene gemessen wurde, vorgesehen war, war eine Messung des Superspiralisierungsgrads ebenfalls auf Transkriptionsebene vorzuziehen.
Der relative Qsc-Wert als ein Maß für den Superspiralisierungsgrad konnte auf Transkriptionsebene durch die Bildung des Quotienten aus der Expression von gyrA und topA, gemessen mittels qRT-PCR, ermittelt werden. Dieser Ansatz hat den Vorteil, dass mit dem selben RNA-Template sowohl die Messung des Superspiralisierungsgrads als auch der dnaQ-Expression erfolgen kann. Unterschiede bei der Vorbereitung der Proben und Durchführung der Experimente wurden dadurch vermieden. Ebenso konnte eine unterschiedliche Probenaufbereitung, wie es bei Verwendung des Luciferase-Assays zur Qsc-Bestimmung und der qRT-PCR zur Qsc-Bestimmung der dnaQ-Expression der Fall gewesen wäre, keinen Einfluss auf die experimentellen Ergebnisse zeigen. Der Materialaufwand war dadurch ebenfalls reduziert. Die Validierung mit demselben Stammkollektiv, das für die Validierung des Luciferase-Assays verwendet wurde, zeigte die Eignung des qRT-Assays für diese Fragestellung (siehe Abbildung 3.33). Der Quotient der Expressionswerte erniedrigte
sich, wenn durch die partielle Inhibierung der Gyrasefunktion weniger negative Superspiralisierung eingeführt wurde (Stamm E. coli KD112: qRT-Assay 51%, Luciferase-Assay 85%; jeweils bezogen auf den Referenzstamm E. coli JTT1 mit 100%). Die Inhibierung der Funktion der Topoisomerase I durch eine Punktmutation im Strukturgen führte zu einer erhöhten negativen Superspiralisierung und ergab einen erhöhten Quotienten der Expressionswerte (Stamm E. coli RS2: Assay 131%, Luciferase-Assay 175%). Das qRT-System reagierte empfindlicher auf verminderte negative Superspiralisierung als der Luciferase-Assay.
Die Bestimmung des Qsc-Grads in dem in Tabelle 3.9 beschriebenen Stammkollektiv zeigte, dass Stämme, die Mutationen in gyrA aufweisen, einen niedrigeren Spiralisierungsgrad haben (vergleiche Abbildung 3.34) als der Referenzstamm E. coli WT ohne gyrA-Mutation.
Für die mittlere logarithmische Wachstumsphase wurden die deutlichsten Unterschiede in den Qsc-Werten bestimmt. Die Verringerung der Qsc-Werte von E. coli MII und E. coli MIII im Vergleich zu E. coli WT war bei OD600nm ≈ 0,6 um durchschnittlich circa 40% stärker ausgeprägt als bei OD600nm ≈ 0,4. Die beobachtete Korrelation des Qsc-Grads mit der Wachstumsphase ist in der Literatur als Korrelation des Überspiralisierungsgrads mit der Wachtumsphase beschrieben worden [236]. Werte für Proben, die bei OD600nm ≈ 0,8 geerntet wurden, zeigen die höchsten im Versuch aufgetretenen Standardabweichungen.
Bei dieser OD beginnt die Kultur in die stationäre Phase überzugehen (vergleiche Kapitel 3.3.5) und es werden unter anderem andere Sigma-Faktoren utilisiert. Sigma-Faktoren assoziieren mit der RNA-Polymerase und erhöhen durch ihre Affinität zur Pribnow-Box und der -35-Region von Promotoren, die Wahrscheinlichkeit einer Anlagerung des RNA-Polymerase-Holoenzyms an den Startpunkt der Transkription [239]. Um sich an verschiedene Umweltbedingungen anzupassen, können unterschiedliche Sigma-Faktoren vermehrt verwendet werden. Unter normalen Bedingungen überwiegt bei E. coli der Sigma-Faktor σ70 [240]. In der stationären Phase wird vermehrt Sigma-Faktor σ38 utilisiert, der für eine Anpassung an umweltbedingte Stresssituationen sorgt [241]. Diese Anpassung erfolgt dadurch, dass verschiedene Sigma-Faktoren unterschiedliche DNA-Erkennungssequenzen aufweisen und somit die Transkription unterschiedlicher Gene erhöhen oder erniedrigen.
Die verhältnismäßig großen Schwankungen bei der Messung bei OD600nm ≈ 0,8 könnten unter anderem darauf zurückgeführt werden. Da sich die Bakterienzellen bei dieser OD am
Übergang zur stationären Phase befinden, könnte die Utilisation der verschiedenen Sigma-Faktoren bei einzelnen Messungen bei demselben Stamm unterschiedlich gewesen sein.
Die Qsc-Werte von E. coli MII (OD600nm ≈ 0,2: 0,74; OD600nm ≈ 0,4: 0,84; OD600nm ≈ 0,6: 0,53) und E. coli MIII (OD600nm ≈ 0,2: 0,61; OD600nm ≈ 0,4: 0,9; OD600nm ≈ 0,6: 0,38) sind relativ ähnlich mit tendenziell niedrigeren Werten bei E. coli MIII. Bestimmungen mit einem Reportergenkonstrukt (BAGEL et al, vergleichbar mit ABUMRAHEIL et al bis auf die Verwendung einer β-Lactamase als Reporter [102]) zeigten bei der OD546nm ≈ 0,5 einen Unterschied im Qsc-Wert zwischen beiden Stämme von 23% und entsprechen dem hier bei der OD600nm ≈ 0,6 ermittelten Unterschied von 15%. E. coli MIII weist in Bezug auf E. coli MII jeweils eine zusätzliche Mutation in den QRDRs von gyrA und parC auf. Aus Abbildung 3.34 geht hervor, dass trotz der vermuteten gegensätzlichen Einflüsse der gyrA- und parC-Mutationen auf den Qsc-Wert, die Mutation in gyrA einen deutlicheren Effekt auf den Qsc-Wert zeigt. Die Vermutung, dass gyrA- und parC-Mutationen einen unterschiedlichen Effekt auf den Qsc-Wert zeigen, beruht auf deren teilweise gegensätzlicher enzymatischer Aktivität (Überspiralisierung versus Relaxierung). Physiologisch befindet sich die DNA bei Eubacteria in einem negativ superspiralisierten Zustand [235] (homöostatische Kontrolle, siehe Kapitel 1.3). Eine Beteiligung der marR-Deletion an der Änderung des Spiralisierungsgrad wird diskutiert [100] (siehe auch Kapitel 4.7). Alle untersuchten Stämme, mit der Ausnahme von E. coli WT, weisen eine marR-Deletion auf und die ermittelten Unterschiede können nicht darauf zurückgeführt werden.
Der niedrigste Qsc-Wert wurde in E. coli MII-3 bestimmt. Der Stamm ging aus E. coli MII durch in vitro Mutagenese (vergleiche Tabelle Tabelle 2.1) hervor und zeigt eine starke Beeinträchtigungen des Wachstums. Die Reduktion auf ein Viertel des Qsc-Wertes von E. coli WT ist vergleichbar mit der von BAGEL et al [100] ermittelten Reduktion um 68%.
Der Qsc-Wert von E. coli MII-4 ist nicht durch die vorliegenden Topoisomerase-Mutationen zu erklären. Der Stamm weist im Vergleich mit E. coli MII nur eine zusätzliche Mutation in parC (Codon für Aminosäure 80, S80I) auf und zeigt einen um weitere 31% reduzierten Qsc-Wert. Von einer parC-Mutation, die die Aktivität der Topoisomerase IV erniedrigt, wäre eine Reduktion des Qsc-Werts nicht zu erwarten.
Die Standardabweichungen der Mittelwerte (maximal ± 30% bei allen Messwerten zwischen OD600nm ≈ 0,2 und OD600nm ≈ 0,6) waren für diese Methode relativ niedrig (siehe Abbildung 3.34). Durch Korrelation der Expressionswerte von gyrA mit den Werten von topA innerhalb derselben Probe, war die Verwendung eines Referenzgens nicht nötig. Da dieselbe RNA-Probe für beide Ansätze (gyrA und topA) verwendet wurde, ist davon auszugehen, dass keine Unterschiede bei der Zellernte, RNA-Isolierung oder Konzentrationsbestimmung vorliegen. Um die ermittelten Qsc-Werte mit der dnaQ-Expression zu korrelieren, wurde im Anschluss an diesen Versuch die Expression von dnaQ mittels qRT-PCR bestimmt.