Expression der Gene der Selenoproteine PrpU und GrdA und deren Cystein-Mutanten in E. coli

Die Proteine PrpU und GrdA weisen in ihrer Aminosäuresequenz ein Selenocystein auf. Der Einbau dieser seltenen Aminosäure erfolgt cotranslational durch ein UGA-Codon. Das Vorhandensein einer Selenocystein-spezifischen-tRNA und des Selenocystein-spezifischen Elongationsfaktors SelB (FORCHHAMMER et al., 1991; LEINFELDER et al., 1988) ist dafür essentiell. Durch ihn erfolgt die Erkennung der SECIS-Struktur (selenocysteine insertion sequence), einer mRNA-Sekundärstruktur, welche downstream des für Selenocystein codierenden UGA-Codons zu finden und ebenfalls essentiell für die Inkorporation von Selenocystein in die Polypeptidkette ist. E. coli-SelB ist nicht in der Lage, SECIS-Elemente aus E.

acidaminophilum zu erkennen, hier kommt es entweder zum Einbau von Tryptophan, der so genannten Tryptophan-Supression (FORCHHAMMER et al., 1989; HIRSH and GOLD 1971; LEINFELDER et al., 1988) bzw.

zum Abbruch der Translation und somit zu einem verkürzten Protein (SCOLNICK et al., 1968). Erst durch die Arbeiten von GURSINSKY (2002) war es möglich, die Gene der Selenoproteine aus E. acidaminophilum heterolog in E. coli zu exprimieren. Durch parallele Expression von selBEA und selCEA mit dem Gen des entsprechenden Selenoproteins in E. coli erfolgte die Erkennung des SECIS-Elementes aus E.

acidaminophilum durch SELBEa und ein Einbau von Selenocystein in das heterolog synthetisierter Protein (GURSINSKY 2002; GURSINSKY et al., 2008).

3.4.4.1. Klonierung von grdA3 und prpU in das Expressionsplasmid pASK-IBA3plus

Da die Gene selB und selC aus E. acidaminophilum auf einem pACYC184-Derivat codiert sind (YANISCH-PERRON et al., 1985), ist es nicht möglich, die Selenoproteine im Stamm E. coli

BL21(DE3)-CodonPlus-RIL zu synthetisieren, da das in diesem Expressionsstamm enthaltene RIL-Plasmid (3.4.1.2.) ebenfalls ein pACYC184-Derivat ist, was zu einer Inkompatibilität beider Plasmide führt. Vorangegangene Arbeiten (GRÖBE 2001) zeigten, dass eine Synthese von Wildtyp-Selenoproteinen mit Hilfe des Expressions-Vektors pASK-IBA3 im Stamm E. coli XL1-Blue MRF` nur zu sehr geringen Expressionsraten führte. Aus diesem Grund sollte neben diesem Vektor eine variierte Form dieses Expressionsplasmides, pASK-IBA3plus, zur Anwendung kommen. Eine veränderte Translations-Initiations-site ermöglicht eine wesentlich höhere Produktion an heterolog synthetisiertem Protein (www.iba-go.de).

Für spätere Untersuchungen sollten sowohl die Selenocystein- als auch die Cystein-Varianten der Gene prpU und grdA heterolog überexprimiert werden. Da sich während dieser Arbeit die C-terminale Fusion mit dem Strep-tag^® II als besser geeignet erwies, sollte auch die Synthese und Reinigung dieser beiden Proteine über eine C-terminale Translationsfusion erfolgen.

Durch GRÖBE (2001) wurden bereits das Wildtyp-prpU und dessen Cystein-Variante (Umwandlung des in frame TGA-Codons zu dem Cystein-Codon TGC durch gerichtete Mutagenese) in das Expressionsplasmid pASK-IBA3 kloniert. Nur im Fall der Cystein-Variante konnte mittels SDS-PAGE und

Western-Blot-Nachweis des Strep-tag^® II mittels StrepTactin-HRP-Konjugat eine Synthese von heterologem PrpU detektiert werden. Eine Überproduktion des Wildtyp-PrpU konnte nicht nachgewiesen werden. Das Gen grdA, welches für das Selenoprotein GrdA codiert, lag zu Beginn dieser Arbeit als Wildtyp- bzw. Cystein-Variante, kloniert in das Expressionsplasmid pASK-IBA3, vor (J. JÄGER, pers. Mitteilung). Es konnten während dieser Arbeit weder für das Wildtyp-Protein noch für die Cystein-Mutante mit diesen vorliegenden Konstrukten eine Synthese nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Aus diesem Grund sollten die Gene beider Proteine als Wildtyp-Variante und im Fall von GrdA auch die Cystein-Variante erneut in pASK-IBA3 und zusätzlich in pASK-IBA3plus kloniert werden, um diese Proteine heterolog zu synthetisieren.

Die Gene prpU und grdA wurden durch PCR mit den Primern prpUIBA3f und prpUP2I3 bzw. GrdAIBA3f und GrdAIBA3r amplifiziert, wobei chromosomale DNA im Fall der Amplifikation der Wildtyp-Gene bzw.

das Plasmid pMUA36 (J. JÄGER, pers. Mitteilung) im Fall der Amplifikation der Cystein-Variante von grdA als template dienten. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden mit BsaI bzw. mit BpiI (grdA) verdaut und in die mit BsaI behandelten Vektoren pASK-IBA3 und pASK-IBA3plus ligiert und anschließend in E. coli XL1-Blue MRF`. Aus jeweils drei der entstandenen Kolonien wurden die Plasmide isoliert und das Insert mittels Sequenzierung überprüft. Die Hybrid-Plasmide wurden entsprechend der Klonierung in pASK-IBA3 mit pPrpUCW (prpU), pPACW bzw. pPACM (Wildtyp-grdA bzw. Cystein-Mutante von grdA) und pPrpUCW+

(prpU), pPACW+ bzw. pPACM+ (Wildtyp-grdA bzw. Cystein-Mutante von grdA) im Fall der Klonierung in pASK-IBA3plus bezeichnet. Bei der Sequenzierung aller Plasmide, welche die Wildtyp-Gene von grdA trugen, zeigte sich, dass in jedem Fall grdA3 amplifiziert und kloniert wurde. Auf die Anzahl der im Genom von E. acidaminophilum vorkommenden Kopien von grdA und weiteren Genen des Glycin-Metabolismus wurde im Abschnitt 3.1. näher eingegangen.

3.4.4.2. Testexpression der Gene der Selenoproteine PrpU und GrdA als Strep-tag^® II-Translationsfusion in E. coli

Wie bereits erwähnt, konnte die heterologe Synthese von Selenoproteinen nur mit Hilfe des vonGURSINSKY

et al. (2008) etablierten Plasmides pASBC4 in E. coli durchgeführt werden. Auf Grund der Inkompatibilität dieses Plasmides mit dem im Expressionstamm E. coli BL21(DE3)-CodonPlus-RIL enthaltenen RIL-Plasmid war die Expression in diesem Stamm nicht möglich. Daher wurde zunächst eine Testsynthese der beiden Selenoproteine PrpU und GrdA im Stamm E. coli XL1-Blue MRF` durchgeführt.

Die Testsynthese erfolgte in 20 ml Selektivmedium, als Inokulum diente eine ebenfalls in LB-Selektivmedium gewachsene Übernacht-Kultur. Nach dreistündiger Induktion des tet-Promotors der Expressionsplasmide erfolgte die Analyse der Proben durch SDS-PAGE bzw. Western-Blot-Nachweis des Strep-tag^® II mittels StrepTactin-HRP-Konjugat. Für das heterolog exprimierte grdA konnte in einer 17,5%igen SDS-PAGE eine zusätzliche Proteinbande mit einer Größe von ca. 20 kDa im Vergleich zur nichtinduzierten Probe bei der Synthese durch pASK-IBA3plus sichtbar gemacht werden. Eine Bande

analoger Größe konnte ebenfalls im Western-Blot nachgewiesen werden. 20 kDa entspricht der Größe von heterolog exprimiertem grdA fusioniert mit dem Strep-tag^® II. Bei der Überproduktion mit Hilfe des Vektors IBA3 konnte keine zusätzliche Bande identifiziert werden. Also war die Verwendung von pASK-IBA3plus notwendig.

Für PrpU konnte weder in der SDS-PAGE noch durch Western-Blot eine zusätzliche Bande bei Synthese durch pASK-IBA3 bzw. pASK-IBA3plus sichtbar bzw. detektiert werden (Daten nicht gezeigt). Daher erfolgte eine weitere Testsynthese der Proteine PrpU und GrdA im Stamm E. coli BL21(DE3). Die Überproduktion beider Proteine erfolgte auch hier mit Hilfe der Plasmide pASK-IBA3 und pASK-IBA3plus.

Die Analyse der nach Testexpression gewonnenen Proben erfolgte ebenfalls durch SDS-PAGE und Western-Blot-Nachweis des Strep-tag^® II mittels StrepTactin-HRP-Konjugat. Bei der Synthese beider Proteine durch das Plasmid pASK-IBA3plus konnte für PrpU eine zusätzliche Bande bei ca. 12 kDa und für GrdA eine bei ca. 20 kDa sichtbar detektiert werden. Bei Expression mittels pASK-IBA3 konnte auch in diesem Stamm weder für prpU noch für grdA eine Überproduktion der Proteine nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).

Da die Expression des Wildtyp-grdA im Stamm E. coli XL1-Blue MRF` wesentlich schwächer war, als im Stamm E. coli BL21(DE3), wurde letzterer auch für die weiteren Versuche für die Expression von Wildtyp-grdA verwendet.

Die Synthese der Cystein-Mutanten von PrpU und GrdA erfolgte im Stamm E. coli BL21(DE3)-CodonPlus-RIL. Für beide Proteine wurden nach Testsynthese und anschließender SDS-PAGE bzw. Western-Blot-Analyse zusätzliche Banden mit Größen von ca. 12 kDa (PrpU) bzw. ca. 20 kDa (GrdA) visualisiert bzw.

detektiert.

3.4.4.3. Synthese und Reinigung von Wildtyp-PrpU und -GrdA und deren Cystein-Varianten

Die Überproduktion beider Wildtyp-Proteine erfolgte im Stamm E. coli BL21(DE3) analog zu 3.4.1.3. im 1 l Maßstab in LB-Selektivmedium (125 µg/ml Ampicillin und 30 µg/ml Chloramphenicol) und dreistündiger Induktion des tet-Promotors mit 0,2 µg/ml Anhydrotetracyclin. Die Überproduktion der Cystein-Mutanten von PrpU und GrdA erfolgte im Stamm E. coli BL21(DE3)-CodonPlus-RIL.

Die Präparation des Rohextraktes erfolgte aus dem Pellet von 100 ml Kultur (Cystein-Varianten von PrpU und GrdA), von 200 ml (Wildtyp-GrdA) bzw. von 250 ml Kultur bei Wildtyp-PrpU. Nach Bindung des Rohextraktes an StrepTactin-Sepharose wurden die ungebundenen Proteine durch Waschen mit 5x1 ml PufferW entfernt und die überproduzierten und mit Strep-tag^® II-fusionierten Proteine mit 6x0,5 ml PufferW mit 2,5 mM Desthiobiotin eluiert. Alle Schritte erfolgten bei 4 °C und unter Gravitationsfluss.

Anschließend wurden die einzelnen Säulenläufe mittels SDS-PAGE und Western-Blot-Nachweis des Strep-tag^® II mittels StrepTactin-HRP-Konjugat überprüft und die Proteinkonzentrationen der einzelnen Elutionsfraktionen mittels BRADFORD-Test bestimmt.

A B 70

120 200

60 50 150 100

40 30 25 20 15 10 85

120

10 85 200

70 60 50 150 100

40 30 25 20 15

M WT MU M WT MU

kDa kDa

PrpU GrdA

Abb. 27: Reinigung der rekombinanten Selenoproteine PrpU (A) und GrdA (B) und deren Cystein-Varianten an StrepTactin-Sepharose nach Synthese im Expressionsvektor pASK-IBA3plus. Die Proben wurden in einem Schägger-Gel (SCHÄGGER 2006) aufgetrennt und durch Coomassie-Färbung sichtbar gemacht.

M_Molekulargewichtsmarker, WT_Elutionsfraktion der Wildtyp-Proteine, MU_Elutionsfraktion der Cystein-Variante der Proteine PrpU und GrdA nach Affinitätschromatographie an StrepTactin-Sepharose. Es wurden jeweils 2 µg der Wildtyp-Proteine und jeweils 5 µg der Cystein-Varianten beider Proteine aufgetragen.

In Abbildung 27 ist zu erkennen, dass sowohl die Wildtyp-Proteine PrpU und GrdA als auch deren Cystein-Varianten innerhalb der dritten Elutionsfraktion mit Proteinkonzentrationen von 1 µg/µl (PrpU-WT), 2 µg/µl (PrpU-MU), 1 µg/µl (GrdA-WT) und 2,5 µg/µl (GrdA-MU) eluierten, wobei die beiden GrdA-Varianten nicht bis zur Homogenität gereinigt werden konnten. Somit konnten aus 250 ml Kulturvolumen 0,5 mg Wildtyp-PrpU und aus 100 ml Kulturvolumen 1 mg der Cystein-Variante von PrpU gereinigt werden. 0,5 mg Wildtyp-GrdA wurden aus 200 ml und 1,25 mg der Cystein-Variante von GrdA wurden aus 100 ml Kulturvolumen gereinigt. Am Beispiel des Selenoproteins PrpU wurde durch MALDI-MS-Analyse bestimmt, dass das heterolog synthetisierte Wildtyp-Protein aus einem Gemisch von Cystein-, Selenocystein- und Tryptophan-Varianten besteht (A. SCHIERHORN,pers. Mitteilung). Die Cystein-Variante des heterolog synthetisierten GrdA zeigte das bereits von DIETRICH et al. (1991) beschriebene Absorptionsspektrum mit Maxima bei 228, 277 und 411 nm sowie Schultern bei 252, 258, 265 und 268 nm (Anhang A.X.).