Expression des ICS1-Gens

WILDERMUTH et al. (2001) haben durch Untersuchungen an sid2 (SA induction deficient)-Mutanten gezeigt, dass die Salizylsäure, die während der Abwehrreaktion der Pflanze gegen Bakterien gebildet und für die SAR benötigt wird, durch die Isochorismat-Synthase (ICS1) synthetisiert wird. ICS1 katalysiert die Reaktion von Chorismat, einem Produkt des Shikimat-Signalwegs, zu Isochorismat, der direkten Vorstufe der Salizylsäure. sid2 (SA induction deficient)-Mutanten haben eine Mutation im ICS1-Gen, wodurch die Funktion der Choristmat-bindenden Domäne zerstört ist.

WILDERMUTH et al. (2001) zeigten, dass sid2-Mutanten sowohl nach Infektion mit virulenten als auch mit avirulenten Pathogenen suszeptibler als der Wildtyp waren und weder Salizylsäure akkumulieren noch PR-Genen exprimieren konnten. Weiterhin führte die Infektion mit avirulenten Pseudomonaden nicht zur Ausbildung einer SAR.

Ein zweites Salizylsäure bildendes Enzym, die Phenylalanin-Ammonium-Lyase (PAL), sorgt für eine gewisse Grundmenge an Salizylsäure in den Pflanzen und spielt im Rahmen des Zelltodes eine Rolle.

Um herauszufinden, welches Enzym für die Salizylsäureproduktion in aca41 und aca38#8 verantwortlich ist, wurde erneut das Blattmaterial uninduzierter Pflanzen geerntet und in einer Northern-Blot Analyse die Expression von ICS1 und PAL untersucht. Dabei zeigte sich, dass das PAL-Gen sowohl in der Kontrollpflanze als auch

in den Mutanten gleich stark exprimiert wurde (ohne Abbildung). Deshalb erschien es unwahrscheinlich, dass dieser Syntheseweg in den Mutantenpflanzen eine Rolle spielt.

aca41

Die ICS1-Expression unterschied sich allerdings deutlich in den Mutanten und der Kontrollpflanze. Während 5GuDe im uninduzierten Zustand kein ICS1 exprimiert, war in aca41 und cpr5 ein deutliches Signal erkennbar. Diese konstitutiv erhöhten Mengen an Isochorismat-Synthase in der Pflanze sorgen anscheinend für eine andauernde Produktion von Salizylsäure und damit auch für die konstitutive Expression der PR-Gene.

28S rRNA

aca41 cpr5

5GuDe

ICS1

Abbildung 16: Expression von ICS1 in den Mutanten aca41 und cpr5. Die RNA wurde aus dem Blattmaterial drei Wochen alter uninduzierter Pflanzen gewonnen. Als Kontrollpflanze diente 5GuDe. Es wurden 10 µg RNA eingesetzt.

Da die Stärke der PR1-Genexpression in der F2-Generation der Rückkreuzung von aca41 mit 5GuDe in den einzelnen Individuen unterschiedlich ausfiel (Kapitel 4.3.1.1), wurde untersucht, ob die Stärke des ICS1-Signals in der F2-Generation ebenfalls variiert. Dazu wurde aca41 mit ICS1::LUC-Pflanzen gekreuzt, die das Luciferase-Gen unter der Kontrolle des ICS1-Promotors exprimieren. Werden ICS1::LUC-Pflanzen, in denen der ICS1-Promotor induziert ist, mit Luciferin behandelt, wird dieses durch die Luciferase abgebaut und dabei Licht emittiert. Das Leuchten der Pflanzen kann mit einer Digitalkamera festgehalten werden. Es wurde erwartet, dass die Pflanzen der F2-Generation, in denen die Mutation aus aca41 vorliegt, nach der Behandlung mit Luciferin leuchten. Als Positivkontrolle wurde parallel die F2-Generation der Kreuzung cpr5 x ICS1::LUC analysiert (Abbildung 17).

A) aca41 x ICS1::LUC

B) cpr5 x ICS1::LUC

Abbildung 17: ICS1-Expression in uninduzierten 5 Wochen alten Pflanzen der F2-Generation der Kreuzung von aca41 bzw. cpr5 mit ICS1::LUC. Die Pflanzen wurden mit 1 mM Luciferin besprüht. A) Lichtbild und Luminiszenzbild von aca41 x ICS1::LUC B) Lichtbild und Luminiszenzbild von cpr5 x ICS1::LUC.

Ist ein rezessives Gen für die ICS1-Expression verantwortlich, müssten ca. 19% der F2-Pflanzen leuchten. Zwar läge in 25% der F2-Pflanzen die Mutation homozygot vor, aber von diesen 25% besitzen wiederum nur 75% das ICS1::LUC Konstrukt in homo- oder heterozygoter Form. Von den 103 analysierten F2-Pflanzen der Kreuzung cpr5 x ICS1::LUC leuchteten 19, was knapp 19% entspricht (Beispiel: Abbildung 17 B). Das zeigt sowohl, dass in cpr5 eine rezessive Mutation für die ICS1-Expression verantwortlich ist als auch, dass die Stärke der Lichtemission nicht davon abhängt, ob ICS1::LUC homo- oder heterozygot vorliegt.

Von den 62 analysierten F2-Pflanzen der Kreuzung aca41 x ICS1::LUC leuchteten 10 Pflanzen, was ca. 16% entspricht. Außerdem variierte die Stärke der Lichtemission in den Pflanzen der F2-Generation und nur zwei Pflanzen leuchteten sehr intensiv (Beispiel: Abbildung 17 A). Es scheint also, dass die Stärke der ICS1-Expression genauso wie die Stärke der PR1-Expression in der F2-Generation nicht homogen ist.

Es ist also wahrscheinlich, dass in aca41 zwei Mutationen oberhalb von ICS1 zusammen wirken müssen, um die ICS1-Expression zu induzieren. Dabei könnte es ein, dass eine der Mutationen ausreicht, um ein schwaches ICS1-Signal zu induzieren. Eine zweite Mutation, die alleine nicht zur ICS1-Expression führt, könnte nötig sein, um das ICS1-Signal der ersten Mutation zu verstärken, damit es der Expression in aca41 entspricht. Da die Stärke des ICS1-Signals die endogenen Salizylsäuremengen und damit auch die Expression von Abwehrgenen beeinflusst, könnte das erklären, warum in der F2-Generation aca41 x 5GuDe PR1 unterschiedlich stark exprimiert wurde.

aca38#8

Die ICS1 Mengen in uninduzierten aca38#8 Pflanzen waren ebenfalls erhöht und mit den ICS1 Mengen in cpr5 vergleichbar (Abbildung 18). Also könnten auch in aca38#8 wie in aca41 die hohen Mengen an freier Salizylsäure über einen ICS1-abhängigen Weg gebildet werden.

28S rRNA

5GuDe aca38#8 cpr5

ICS1

Abbildung 18: Expression von ICS1 in den Mutanten aca38#8 und cpr5. Die RNA wurde aus dem Blattmaterial drei Wochen alter uninduzierter Pflanzen gewonnen. Es wurden 10 µg RNA eingesetzt.

4.3.4 Infektion mit dem bakteriellen Pathogen Pseudomonas syringae