Für die funktionelle Analyse des Genoms von B. licheniformis wurde ein DNA-Microarray erstellt, auf dem nach Möglichkeit jeder ORF des Genoms von B. licheniformis vertreten ist.
Hierfür gibt es zum einen das sehr teure Verfahren einen Abschnitt jedes ORFs als Oligo-nukleotid zu synthetisieren und einen so genannten Oligochip zu erstellen. Eine weitere Mög-lichkeit, welche in dieser Arbeit Anwendung fand, besteht darin, ca. 300 - 500 bp große, spe-zifische Fragmente der ORFs mittels PCR zu amplifizieren. Im Folgenden wird beschrieben, nach welchem Verfahren Primer innerhalb der ORFs abgeleitet und die Fragmente amplifi-ziert und auf den Microarray gespottet wurden.
2.15.1. Primergenerierung
Im Rahmen dieses Projektes sollten für alle ORFs, mit einer Mindestlänge von 300 bp, Pri-merpaare generiert werden, wobei jeder Primer eine durchschnittliche Länge von 17-18 bp und eine Schmelztemperatur von 60°C besitzen sollte. Um diesen Vorgang für die mehr als 4000 ORFs zu automatisieren, wurde ein Programm genutzt (Armin Ehrenreich, unveröffent-licht), welches unter vorgegebenen Parametern passende Primer für die Amplifikation der ca.
300 bp großen ORF Fragmente (probes) generierte.
Bei einem Großteil der Reaktionen konnte mit nur einem spezifischen und einem Standard-primer gearbeitet werden (siehe Ergebnisse 3.7.1.), hier wurde keine chromosomale DNA als Template eingesetzt, sondern Plasmide der Genbank, welche zur Sequenzierung des Genoms angefertigt wurde. In diesen Fällen wurden von dem Programm zur Primergenerierung Inserts der Plasmide gesucht, deren Ende oder Anfang innerhalb eines ORFs lokalisiert waren (Ab-bildung 2.11.). Auf diese Weise konnte der Standard Forward oder Reverse Primer, der schon zur Rohsequenzierung genutzt wurde, für eine deutlich kostengünstigere Amplifikation der probes eingesetzt werden. ORFs, in deren Sequenzbereich kein Insertanfang oder -ende ge-funden werden konnte, wurden mit zwei spezifischen Primern amplifiziert. Wenn möglich wurde die DNA eines den 300 bp Bereich überspannden Inserts der Plasmidgenbank als Template eingesetzt, um die Spezifität der PCR Reaktion, im Vergleich zum Einsatz chromo-somaler DNA, zu erhöhen. ORFs in deren Bereich keinerlei in Frage kommendes Inserts lag, z.B. in Regionen von Lücken, welche über PCR geschlossen wurden, kamen zwei spezifische Primer auf chromosomaler DNA zum Einsatz. Die Synthese der Primer wurde bei der Firma QIAGEN Operon, Köln, in Auftrag gegeben.
ORF A Spezifischer Primer
A
Standard reverse/forward
-Primer
Abbildung 2.11.: Schematische Darstellung der Primerwahl für einen ORF A, dargestellt im Template display des Programms GAP4. Im Bereich des ORFs A liegen mehrere Inserts der Plasmidgenbank, deren forward und reverse Läufe je durch einen orangefarbenen und einen grünen Pfeil, verbunden durch eine schwarze Linie, dargestellt sind. Drei Inserts wurden als Template für die Amplifikation der probes ausgewählt, wobei der entsprechende Standardprimer (orangefarbene Kästchen) eingesetzt werden konnte. Ein spezifischer Primer A wurde in einem Abstand von ca. 300 bp gewählt (gelbes
2.15.2. Amplifizierung der ‚probes’
Die Amplifizierung der probes erfolgte im 96 well Maßstab. Die Primer A und B wurden je 20 µM und die Plasmid DNA in 1/10 Verdünnungen der Sequenziergenbank in 96 well Plat-ten vorgelegt und bei 20°C gelagert. Die PCR Reaktion erfolgte ebenfalls im 96 well Maß-stab, so dass mit einer Achtkanalpipette lediglich Primer A, Primer B und die Template DNA zusammengeführt und 90 µl Mastermix hinzugegeben werden mussten.
Mastermix für 96x 100 µl Chip PCR Ansätze: Chip PCR Ansatz:
200 µl dNTP’s (10 mM jeweils) 1000 µl 10x PCR-Puffer
2000 µl 5x Q-Solution
70 µl Taq (3,5 U/100 µl PCR-Ansatz) ad 9000µl H2Obidest
5 µl Primer A (20 µM) 5 µl Primer B (20 µM) 2 µl Template DNA 90 µl Mastermix
Die Amplifikation erfolgte mittels Standard PCR (2.7.1.), wobei die Elongationszeit auf 45 s herabgesetzt wurde. Im Anschluss an die PCR wurden die Produkte gelektrophoretisch über-prüft (1,7%ig Agarose, 90 min 90 V). Die Aufreinigung erfolgte, wie unter 2.4.5. beschrieben.
Für die Elution der probes wurden 65 µl 70°C warmes H2Obidest/steril eingesetzt.
2.15.3. Spotten und UV-Immobilisierung
Das Spotten der probes erfolgte mit dem Lucidea Spotter der Firma Amersham Biosiences nach dem Prinzip des ‚contact printings’. Ein Druckkopf mit 24 Nadeln, jede geformt wie ein winziger Füllfederhalter (Abbildung 2.12.), nimmt aus Mikrotiterplatten pro Nadel ca. 200 nl probes auf, um dann mit hoher Präzision 100 pl Flüssigkeit pro Spot auf die Chipoberfläche zu setzten. Auf diese Weise ist es möglich 20000 einzelne Spots auf ein Microarray mit den Maßen eines Objektträgers (2,5 cm x 7,5 cm) zu setzten, wobei jeder Spot einen Durchmesser von 150 µm aufweist und der minimale Abstand der Spots 30 µm beträgt. In dieser Arbeit wurden Aminosilan slides der Firma Amersham Biosiences verwendet, welche durch die Gasbehandlung von Glasslides mit 3-aminopropyltrimethoxysilan hergestellt werden. Diese Modifikation des slides ermöglicht das Binden von DNA durch Interaktion zwischen dem negativ geladenen Rückgrat der Nukleinsäure und der positiv geladenen Aminosilanoberflä-che.
Abbildung 2.12.: Nadel des Druckkopfes zum spotten von probes auf Microarrays
Im Vorfeld wurden die probes aus jeweils vier 96 well Platten auf eine 384 well Platte (Fir-ma) überführt und 1:1 mit DMSO zur Denaturierung versetzt. Das Spotten der probes erfolgte in Blöcken von 16 x 11 Spots, wobei jeder Block doppelt auf den Chip gesetzt wurde. Das heißt, in jeder Blockreihe, bestehend aus 4 Blöcken, sind jeweils die ersten beiden und die letzte beiden Blöcke identisch. In den ersten acht Blockreihen wurde jeweils eine so genannte scorecard mitgeführt. Hierbei handelt es sich um spezifische DNA (LucediaTM Universal Sco-reCardTM, AMERSHAM Biosciences, Freiburg), welche später zur Normalisierung der Mic-roarraydaten dient.
Nach dem Spotten der probes erfolgte eine so genannte UV-Immobilisierung mit dem UVC500 UV Crosslinker (HOEFER, San Francisco). Durch das Bestrahlen der gespotteten Chips mit Licht einer Energie von 500 µJ/cm2 für 5 min wurde die Bindung der DNA Frag-mente an die Chipoberfläche intensiviert.
Die geprinteten Microarrays sind sehr feuchtigkeitsempfindlich und werden daher im Exsik-kator bei Unterdruck über einem Trocknungsmittel aufbewahrt.