Anaerobes Wachstum

Unter anaeroben Bedingungen ist die Denitrifikation, die dissimilatorische Nitratreduktion unter Freisetzung von molekularem Stickstoff, eine wichtige Form der Energiegewinnung für Bakterien. Anstelle von Sauerstoff dient Nitrat als terminaler Elektronenakzeptor der At-mungskette. Im Gegensatz zur assimilatorischen Nitratreduktion werden die Endprodukte der Denitrifikation, molekularer Stickstoff oder Stickoxid, nach außen abgegeben und nicht für die Synthese von Aminosäuren verwendet. In vielen Lehrbüchern werden als klassische De-nitrifikanten Pseudomonas Spezies und Bacillus Arten, unter anderem B. licheniformis, ge-nannt (Sneath et al., 1986). Weiterhin beschrieb im Jahre 1978 eine französische Arbeitsgrup-pe um M. Durand die Denitrifikation einiger B. licheniformis Stämme (Pichinoty et al., 1978).

Entgegen den Erwartungen konnte im Genom von B. licheniformis DSM13 nicht die voll-ständige Enzymausstattung für die Denitrifikation gefunden werden. Lediglich ein Gen, wel-ches eventuell für eine einzelne Untereinheit der NO-Reduktase codieren könnte und die Ge-ne der dissimilatorischen Nitrat-Reduktase (narGHIJ) wurden innerhalb eines Clusters mit dem Gen des Transkriptionsregulators der anaeroben Gene (fnr) identifiziert. Die Existenz der

dissimilatorischen Nitrat-Reduktase ist jedoch nicht unbedingt als ein Indiz für die Denitrifi-kation zu werten, da sie ebenso für die NitratammonifiDenitrifi-kation notwendig ist. Experimentell ließ sich für B. licheniformis DSM13 und einige andere B. licheniformis Stämme (DSM14, DSM1913, DSM1969, DSM12369 und DSM12370) ebenfalls keine Denitrifikation nachwei-sen. Möglicherweise handelt es sich bei der Untereinheit der potentiellen NO-Reduktase um die nicht mehr funktionsfähigen Überreste eines Genclusters der Denitrifikation.

Anaerobe Ribonukleotid-Reduktase.

Ein interessanter Aspekt eröffnete sich mit der Identifizierung der Gene einer anaeroben Ri-bonukleotid-Reduktase der Klasse III (BLi03824) und zwei potentiellen zugehörigen Aktivie-rungsenzymen (BLi03823, BLi04172) im Genom von B. licheniformis. Ribonukleotid-Reduktasen katalysieren die Reduktion von Ribonukleosid-Triphosphaten zu den entspre-chenden Desoxyribonukleotiden, welche essentiell für die DNA-Synthese sind. Diese Enzyme werden in drei Klassen eingeteilt, wobei Ribonukleotid-Reduktasen der Klasse I Sauerstoff benötigen, Klasse II Enzyme unabhängig von Sauerstoff agieren und auf Enzyme der Klasse III Sauerstoff toxisch wirkt. Bisher wurden die anaeroben Ribonukleotid-Reduktasen von E. coli und von Lactococcus lactis isoliert und charakterisiert (Reichard, 1993; Torrents et al., 2000). Hier handelt es sich um einen Gram-negativen und einen Gram-positiven Organismus, für deren anaerobe Ribonukleotid-Reduktasen der Klasse III ein gemeinsames generelles Funktionsprinzip nachgewiesen wurde (Torrents et al., 2000). Entscheidend für die katalyti-sche Aktivität der anaeroben Ribonukleotid-Reduktase ist ein Sauerstoff-sensitives Glycyl-Radikal. Für die Generierung des Glycyl-Radikals und damit für die Aktivierung der Ribo-nukleotid-Reduktase ist ein spezifisches Aktivierungsenzym zuständig (Sun et al., 1995). An-hand der Genomsequenz konnten in mehreren Gram-negativen Bakterien, Gram-positiven Bakterien und Archaeen vollständige Sequenzen für die anaerobe Ribonukleotid-Reduktase identifiziert werden (Torrents et al., 2000). B. cereus besitzt ebenfalls diese Gene und ist nachweislich in der Lage, anaerob zu wachsen (Sneath et al., 1986). Eine BLAST Analyse der Arbeitsgruppe um D. P. Nagle zeigte, dass in allen verfügbaren Bacillus-Sequenzen putative anaerobe Ribonukleotid-Reduktasen der Klasse III gefunden werden konnte, außer in B. subti-lis (Folmsbee et al., 2004). Weiterhin konnten sie zeigen, dass B. subtilis und Bacillus moja-vensis zum strikt anaeroben Wachstum die Zugabe von DNA oder Desoxyribonukleosiden benötigen. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit dem Fehlen einer anaeroben Ribonukleo-tid-Reduktase in B. subtilis, zeigen aber auch, das B. subtilis in der Lage ist, diesen Mangel durch Aufnahme externer DNA oder Desoxyribonukleoside auszugleichen. Untersuchungen

stoffen zu versorgen und die Sporulation herauszuzögern (Gonzalez-Pastor et al., 2003). Zu den Nährstoffen, welche durch die Lyse von Zellen zugänglich werden, gehören auch DNA und Desoxyribonukleotide. Hypothetisch wäre es B. subtilis auf diese Weise auch unter Sau-erstoffmangel möglich, für einen begrenzten Zeitraum die DNA-Synthese aufrecht zu erhal-ten.

B. licheniformis ist, nach in dieser Arbeit geschilderten Experimenten (3.6.1.), in der Lage anaerob in Minimalmedium, ohne weitere Zusätze und mit Glucose als einziger C-Quelle zu wachsen. Nach den obigen Ausführungen deutet dies auf eine Aktivität der identifizierten Ribonukleotid-Reduktase in vivo hin. Die vergleichende Analyse der anaeroben Ribonukleo-tid-Reduktase von E. coli und Lactococcus lactis verweist auf eine hohe Konservierung des Funktionsprinzips dieses Enzyms (Torrents et al., 2000). Ob dies für die B. licheniformis Ri-bonukleotid-Reduktase ebenfalls zutrifft, erfordert detaillierte biochemische und proteinche-mische Untersuchungen. Auch in diesem Zusammenhang lässt sich eine größere Flexibilität von B. licheniformis gegenüber B. subtilis, hinsichtlich der Anpassung an eine unzureichende Sauerstoffversorgung, erkennen.

4.2.3. N-Stoffwechsel

Sowohl B. licheniformis als auch B. subtilis weisen eine hohe metabolische Diversität hin-sichtlich ihrer Fähigkeiten zur Nutzung unterschiedlicher Stickstoff-Quellen auf. Im Zuge der Adaptation an ihre saprophytische Lebensweise sind sie in der Lage, mittels extrazellulärer Enzyme aus exogenen Reservoirs, wie Proteinen, Peptiden und Aminosäuren, Stickstoff zu akquirieren. Beide Organismen verfügen diesbezüglich über eine Glutamat-spezifische Pro-tease (mpr), zwei Serinproteasen (vpr, epr), zwei weitere Proteasen (yrrN, yrrO) und die Pep-tidase T (pepT) (s. Tabelle 3.6.). Zusätzlich besitzt B. licheniformis eine Zink-Protease (BLi01909), welche kein Homolog in B. subtilis aufweist (s. Tabelle 3.7.). Beide Organismen verfügen über die Gene der Schlüsselenzyme für die Stickstoff-Assimilation, was auf eine ähnliche Funktionsweise der Systeme hinweist (Rey et al., 2004). Dazu gehören die Gluta-min-Synthetase (GlnA), das wichtigste Enzym der NH3-Assimilation, ihr Transkriptions-repressor (GlnR), der Transkriptionsregulator TnrA der globalen Stickstoff-Regulation, der Ammonium-Transporter (NrgA) und die Gene des Nitrat-Transporters NasA, der assimilatori-sche Nitrat-Reduktase NasBC und der assimilatoriassimilatori-schen Nitrit-Reduktase NasDE. Glutamin dient als Ausgangsmolekül nahezu aller Aminogruppen und wird in erster Instanz durch die Glutamin-Synthetase bereitgestellt. Über die Nitratassimilation akquiriert die Zelle ebenfalls

NH3, dieser Prozess ist aber mit einem höheren Energieaufwand verbunden. Aus diesem Grund erfolgt eine Repression der beteiligten Enzyme durch Ammonium.