4.3 Ergebnisse des Hauptversuches II
4.3.2 Ergebnisse der molekularbiologischen Untersuchungen der Rinderkotproben
8 (3,9 %)
87 (42,2 %)
111 (53,9 %)
positiv negativ
falsch-positiv falsch-negativ
Abbildung 25: Ergebnisse der Untersuchungen der Rinderkotproben (n = 206) mittels Real-Time PCR im Vergleich zu den kulturellen Untersuchungen
In Bezug auf die kulturellen Untersuchungsergebnisse der 206 Rinderkotproben konnte für das Real-Time PCR-Verfahren eine Spezifität von 100 % und eine Sensitivität von 91,6 % ermittelt werden.
Der errechnete Kappa-Index betrug bei dem Vergleich der Ergebnisse der Real-Time PCR mit denen der Kotkultur 0,92. Dieser hohe Kappa-Wert verdeutlicht eine nahezu vollständige Übereinstimmung der Ergebnisse dieser beiden Nachweisverfahren (Sachs, 1992).
Auch hier konnte mit dem Chi-Quadrat-Unabhängigkeitstest aufgrund der Berechnungen (Chi2 = 175,97; p < 0,0001; Programm: BiAS; Ackermann, 1998) die Abhängigkeit der beiden Nachweisverfahren festgestellt werden.
Weiterhin wurde der McNemar-Test (Programm: BiAS; Ackermann, 1998) herangezogen, um sicherzustellen, dass sich die Untersuchungsergebnisse der beiden Nachweisverfahren signifikant unterscheiden und nicht nur zufällige Ergebnisschwankungen vorliegen. Die Berechnungen zeigen (p = 0,0078) eine signifikante Abweichung der Ergebnisse der beiden Nachweisverfahren auf und schließen einen rein zufälligen Unterschied der Ergebnisse mit großer Sicherheit aus.
B) Ergebnisse der nested-PCR
In Tabelle 42 sind die Ergebnisse der nested-PCR im Vergleich zu den kulturellen Ergebnissen der nativen Rinderkotproben (n = 206) dargestellt. In Übereinstimmung mit den kulturellen Ergebnissen detektierte das nested-PCR-Verfahren 80 Kotproben positiv und 111 Proben negativ. 15 Proben wurden falsch-negativ und keine Probe falsch-positiv detektiert. In Abbildung 26 sind die Ergebnisse
des nested-PCR-Verfahrens in Bezug auf die Ergebnisse des kulturellen Nachweises graphisch dargestellt.
Tabelle 42: Übersicht der Ergebnisse der nested-PCR und der kulturellen Untersuchungen der Rinderkotproben (n = 206) im Vergleich
Kultur-positive Proben Kultur-negative Proben Summe nested-PCR –
positive Proben
80 (84,2 %) richtig positiv
0 (0,0 %)
falsch positiv 80
nested-PCR – negative Proben
15 (15,2 %) falsch-negativ
111 (100,0 %)
richtig negativ 126
Summe 95 111 206
111 (53,9 %)
80 (38,8%) 15 (7,3 %)
positiv negativ
falsch-positiv falsch-negativ
Abbildung 26: Ergebnisse der Untersuchungen der Rinderkotproben (n = 206) mittels nested PCR im Vergleich zu den kulturellen Untersuchungen
In Bezug auf die kulturellen Untersuchungsergebnisse der 206 Rinderkotproben konnte für das nested-PCR-Verfahren eine Spezifität von 100 % und eine Sensitivität von 84,2 % ermittelt werden.
Der errechnete Kappa-Index betrug bei dem Vergleich der Ergebnisse der nested-PCR mit denen der Kotkultur 0,59. Dieser Kappa-Wert verdeutlicht eine starke Übereinstimmung der Ergebnisse dieser beiden Nachweisverfahren (Sachs, 1992).
Um eine signifikante Abhängigkeit der beiden Nachweisverfahren zu bestätigen, wurde auch hier der Chi-Quadrat-Unabhängigkeitstest (Programm: BiAS; Ackermann, 1998) angewendet. Die Berechnungen (Chi2 = 152,82; p < 0,0001) zeigen einen signifikante Abhängigkeit der Nachweisverfahren auf.
Die Berechnungen des McNemar-Testes (p = 0,0003; Programm: BiAS; Ackermann, 1998) zeigen auch hier eine signifikante Abweichung der Ergebnisse der beiden Nachweisverfahren auf und schließen einen rein zufälligen Unterschied der Ergebnisse mit großer Sicherheit aus.
Die Abbildung 27 zeigt vergleichend die mit dem jeweiligen Nachweisverfahren detektierten hochgradig (> 100 Kolonien), mittelgradig (10-50 Kolonien) und geringgradig (< 10 Kolonien) MAP-ausscheidenden Rinder. Das Real-Time PCR-Verfahren konnte sämtliche hoch- und mittelgradige Ausscheider nachweisen, während 8 geringgradig MAP-ausscheidende Rinder nicht erfasst wurden.
Mit dem nested-PCR-Verfahren konnten 2 hoch-, 1 mittel- und 12 geringgradige Ausscheider nicht festgestellt werden.
18 17
45
22 18
47
30 18
47
0 10 20 30 40 50
Anzahl der geringgradigen
Ausscheider Anzahl der mittelgradigen
Ausscheider Anzahl der hochgradigen
Ausscheider
nested-PCR Real-Time PCR Kultur
Abbildung 27: Vergleich der mittels kultureller Anzucht, Real-Time PCR und nested-PCR ermittelten gering-, mittel- und hochgradig MAP-ausscheidenden Tiere
5 DISKUSSION
Die Paratuberkulose ist eine weltweit verbreitete, bislang unheilbare Erkrankung der Haus-, Zoo- und Wildwiederkäuer, die in der Regel tödlich verläuft und im landwirtschaftlichen Sektor zu erheblichen finanziellen Verlusten führt. Die diagnostischen Möglichkeiten bei mit MAP infizierten Tieren sind aufgrund der spezifischen Pathogenese der Paratuberkulose begrenzt. Der derzeit als „gold standard”
geltende kulturelle Nachweis des Erregers (Chiodini et al., 1984a; Hietala, 1992; Collins et al., 1993) ist aufgrund der langen Anzuchtdauer von bis zu 16 Wochen bei gleichzeitig hohen Kosten und der Kontaminationsgefahr der Nährmedien problematisch. Erschwerend kommt hinzu, dass persistent infizierte, klinisch unauffällige Rinder, die MAP jahrelang intermittierend mit dem Kot ausscheiden, selbst bei wiederholten kulturellen Kotuntersuchungen als falsch-negativ detektiert werden können (Köhler et al., 2005).
Der direkte mikroskopische Erregernachweis aus Rinderkot mittels Ziehl-Neelsen-Färbung gelingt meist erst in einem fortgeschrittenen Krankheitsstadium und ist, ebenso wie der kulturelle Nachweis, aufgrund der intermittierenden Ausscheidung des Erregers mit dem Kot nicht immer möglich.
Auch der serologische Nachweis von MAP ist mit Schwierigkeiten verbunden, da der Erreger oftmals von Rindern, die sich in der klinisch inapparenten Phase der Erkrankung befinden, intermittierend mit dem Kot ausgeschieden wird, bevor eine Serokonversion nachweisbar ist. Hinzu kommt, dass die in der blutserologischen Diagnostik eingesetzten ELISA-Systeme im Hinblick auf ihre Sensitivität und Spezifität zum Teil erheblich differieren (Köhler, 2005).
Vor dem Hintergrund dieser Schwierigkeiten bei der Paratuberkulosediagnostik in Rinderbeständen kommt den molekularbiologischen Nachweisverfahren eine besondere Bedeutung zu (Stephan, 2007).
Die PCR-Technologie ermöglicht einerseits die frühzeitige Bestätigung des mikrobiologischen Befundes und erlaubt andererseits die Analyse unterschiedlicher Probenmatrizes wie Rinderkot ohne zeitintensive Voranreicherung (Collins et al., 1993; Fang et al., 2002). Hier finden überwiegend PCR-Verfahren auf Basis der repetitiven DNA-Insertionssequenz IS900 Verwendung (Kim et al., 2002;
Bull et al., 2003). Allerdings konnten in den letzten Jahren nicht nur Homologien zwischen IS900 und verschiedenen anderen Insertionselementen wie IS110 von Streptomyces coelicolor, IS116 von Streptomyces clavuligerus sowie IS902 von Mycobacterium avium ssp. silvaticum nachgewiesen werden (Green et al., 1989), sondern auch Kreuzreaktionen mit anderen non-MAP-Mykobakterien, die zu falsch-positiven Ergebnissen in der molekularbiologischen Diagnostik führten (Cousin et al., 1999; Englund et al., 2002; Fang et al., 2002; Kim et al., 2002; O'Mahony und Hill, 2002; Khare et al., 2004; O'Mahony et al., 2004; Vansnick et al., 2004). Demgegenüber sind die Zielregionen ISMav2 und F57 mehrfach als geeignet für den spezifischen MAP-Nachweis beschrieben worden (Poupart et al., 1993; Strommenger et al., 2001; Godfroid et al., 2005; Bosshard et al., 2006; Schönenbrücher et al., 2008).
Gegenüber konventionellen PCR-Verfahren weisen Real-Time PCR-Verfahren diverse Vorteile auf.
Die Real-Time PCR ermöglicht nicht nur einen qualitativen, sondern gleichzeitig auch einen
quantitativen Erregernachweis. Des Weiteren sinkt die Kontaminationsgefahr der Proben erheblich, da die Probengefäße während der Untersuchung nicht geöffnet werden müssen. Zusätzlich besitzen TaqMan® Real-Time PCR-Verfahren durch das Mitführen der TaqMan® Sonde als drittes spezifisches Olignukleotid eine höhere analytische Spezifität. Aber auch der Arbeitsaufwand reduziert sich, da keine aufwändige Agargelelektrophorese im Anschluss an den PCR-Lauf erforderlich ist.
Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit ein institutseigenes TaqMan® Real-Time PCR-Verfahren basierend auf den MAP-Markern F57 und ISMav2 zum Nachweis von MAP aus Rinderkot verwendet. Weiterhin wurde eine interne Amplifikationskontrolle (IAK) mitgeführt, um falsch-negative Ergebnisse ausschließen zu können. Das Mitführen einer IAK bei einer diagnostischen PCR ist dringend zu fordern. Allerdings weisen bislang die meisten PCR-Systeme keine IAK auf (Stephan, 2007).
Im optimalen Fall erfolgt die PCR-Diagnostik Matrix-unabhängig. Die gesuchte Erreger-DNA wird dabei aus Subkulturen verdächtiger Erregerkolonien, die möglichst als Reinkultur vorliegen sollten, extrahiert. Allerdings ist diese Vorgehensweise bei der Paratuberkulose hinfällig, da aus Kot isolierte MAP-Reinkulturen erst nach mehreren Monaten vorliegen würden. Verschiedene Labore empfehlen eine Kombination von Kotkultur und PCR-Bestätigung (Klarmann und Moss, 2006). Dabei wird frühestens in der 6. Woche der Kultivierung eine Spülung der Medien vorgenommen und die Spülflüssigkeit molekularbiologisch auf das Vorkommen von MAP untersucht. Damit ist die Untersuchung zwar unabhängig von der Matrix, doch liegen die Untersuchungsergebnisse erst nach 6 Wochen vor und durch kontaminierte Medien können Verluste auftreten. Wesentlich schneller, kostengünstiger und unabhängig von Kontaminationen der Medien ist der molekularbiologische Nachweis des Erregers direkt aus der Matrix Rinderkot. Demzufolge konzentrierte sich diese Arbeit auf die Validierung des institutseigenen TaqMan® Real-Time PCR-Verfahrens für den Direktnachweis von MAP aus Rinderkot.