7H9-Flüssignährmedium) schüttelnd und unter Zugabe von Tween 80 sowie sterilen Keramikkügelchen kultiviert.
d) Schlussfolgerungen
Abschließend bleibt bei den Einmischversuchen 1, 2 und 3 festzuhalten, dass die ausgeprägte Zellaggregatbildung der ursprünglichen MAP-Suspension aus dem MGIT-Flüssignährmedium entscheidenden Einfluss auf die Nachweisrate der TaqMan® Real-Time PCR beim Nachweis von MAP aus artifiziell kontaminierten Rinderkotproben nimmt. Die inhomogene Verteilung des Erregers in den Rinderkotproben der jeweiligen Verdünnungsstufen kann insbesondere bei niedrigen Erregerkonzentrationen zu Nachweisverlusten in der PCR führen, was bei einem Vergleich der Ergebnisse des Vorversuches (Einmischversuche 1, 2 und 3) und denen des Hauptversuches I (Einmischversuche 4, 5 und 6) noch näher erläutert wird. Weiterhin führte die DNA-Extraktion bei den Einmischversuchen 1, 2 und 3, basierend auf dem Standard-Kitsystem Q (QIAamp DNA Stool Mini Kit®) der Firma Qiagen, zu erheblichen DNA-Verlusten. Dadurch konnte mit der TaqMan® Real-Time PCR nur bei einer Erregerkonzentration von ca. 104 KbE/g Rinderkot eine Nachweisrate von 100 % erreicht werden. Um die Nachweisrate der Real-Time PCR zu verbessern, wurden Modifikationen des Kitsystems der Firma Qiagen vorgenommen und ein weiteres Standard-Kitsystem sowie ein modifiziertes Standard-Kitsystem der Firma Roche in die Untersuchungen mit aufgenommen (Kot-Einmischversuche 4, 5 und 6).
Waschpuffer, Proteinase K, Ethanol und der Zugabe einer InhibitEX-Tablette zur Neutralisierung von PCR-Inhibitoren. Da MAP sehr thermostabil ist, wurden die Kotproben bei dem Standard-Protokoll Q der Firma Qiagen, durch eine 5minütige Inkubation bei +95 °C thermisch aufbereitet. Bei dem modifizierten Protokoll Qm der Firma Qiagen erfolgten während des Arbeitsprotokolls zwei Thermisierungsschritte von jeweils 10 Minuten bei +95 °C.
Bei den DNA-Extraktionsverfahren der Firma Roche erfolgt die chemische Aufbereitung der Proben mittels enzymatischer Puffer, verschiedener Waschpuffer, Lysozym, Proteinase K und Isopropanol.
Als thermischer Aufbereitungsschritt wurden die Kotproben bei beiden Protokollen R und Rm einer Inkubation bei +95 °C für 10 Minuten unterzogen. Die gezielte Bindung der DNA-Moleküle wurde bei allen DNA-Extraktionsverfahren durch eine Silikagel-Membran gewährleistet.
Die modifizierten DNA-Extraktionsverfahren Qm und Rm enthielten zusätzlich einen mechanischen Aufbereitungsschritt. Dabei wurden die Proben in beiden Protokollen mehrfach im Ribolyser unter Zusatz von Keramikkügelchen geschüttelt. Um eine übermäßige Schaumbildung bei der mechanischen Aufbereitung (4 x Stufe 6 für jeweils 20 Sekunden im Ribolyser) der Kotproben zu vermeiden, wurde bei dem Protokoll Qm nach Absprache mit der Firma Qiagen eine DX-Lösung zu dem üblicherweise eingesetzten ASL-Puffer zugegeben. Die DX-Lösung wurde zu Versuchszwecken zur Verfügung gestellt. Sie stammte aus einem anderen Kit-System der Firma Qiagen und ist einzeln kommerziell nicht erhältlich. Die DX-Lösung wurde nur bei dem DNA-Extraktionsverfahren Qm der Firma Qiagen eingesetzt; bei dem Protokoll Rm der Firma Roche wurde auf den Zusatz der DX-Lösung verzichtet.
Um dennoch eine vermehrte Schaumbildung zu vermeiden, wurde die mechanische Aufbereitung der Rinderkotproben modifiziert. Ohne den Zusatz von DX-Lösung wurden die Proben nur 2 x bei Stufe 6 für jeweils 20 Sekunden in dem Ribolyser geschüttelt.
b) Koteinwaage
Ein weiterer bedeutsamer Unterschied zwischen den Protokollen besteht in der Koteinwaage zu Beginn der DNA-Extraktion. Bei dem Standard-Protokoll Q der Firma Qiagen wurden gemäß den Vorschriften des Herstellers maximal 220 mg Rinderkot pro Ansatz eingewogen, dagegen bei dem modifizierten Protokoll Qm der Firma Qiagen 1 g und bei den beiden Protokollen der Firma Roche sogar 1,5 g Rinderkot. Durch eine möglichst hohe Koteinwaage pro PCR-Ansatz steigt die Wahrscheinlichkeit des Erregernachweises entsprechend an, was insbesondere für den Nachweis von Rindern, die den Erreger in nur geringen Konzentrationen mit dem Kot ausscheiden von Bedeutung ist.
c) Zellaggregatbildung von MAP
Aber auch die Größe der MAP-Zellaggregate in der Erregersuspension ist entscheidend für die Nachweisrate der Real-Time PCR. Wie bereits erwähnt, wurde bei den Einmischversuchen des Vorversuches das MGIT-Flüssignährmedium, das zu einer hochgradigen Aggregatbildung des Erregers neigte, als Anzuchtnährmedium des MAP-Stammes MAP 423 eingesetzt. Um die hochgradige Aggregatbildung des Erregers zu reduzieren, erfolgte dagegen bei den Einmischversuchen 4, 5 und 6 die Kultivierung der MAP-Stämme MAP 423 und J 27 in dem Middlebrook 7H9-Flüssignährmedium mit den Zusätzen Tween 80 und Mycobactin J. Tween 80 beeinflusst dabei gezielt die mykobakterielle Zellwand und reduziert die Nesterbildung von MAP in dem Flüssignährmedium sowie eine Nesterneubildung in der Matrix Rinderkot (van Boxtel et al., 1990; Wards, 1996). Als weitere Maßnahme zur Reduzierung der Aggregatbildung des Erregers wurden die Flüssigmedien mit den MAP-Stämmen MAP 423 und J 27 für die Einmischversuche 4, 5 und 6 schüttelnd unter Zugabe von sterilen Keramikkügelchen inkubiert. Durch den Einsatz des Middlebrook 7H9-Flüssigmediums mit dem Zusatz von Tween 80 konnte so die Aggregatbildung von MAP gezielt vermindert werden. Weitere mechanische Aufbereitungsschritte zur Homogenisierung der anfänglichen Erregersuspension waren – wie die mikroskopischen Untersuchungen belegten – bei den Einmischversuchen 4, 5 und 6 nicht erforderlich. Obwohl Tween 80 laut Literaturangaben auch einen inhibitorischen Effekt auf das Wachstum von Mykobakterien nehmen kann, wurde bei den Untersuchungen von Wards (1996), in denen das Wachstum verschiedener Mycobacterium spp.
inklusive MAP in bzw. auf unterschiedlichen Fest- und Flüssignährmedien getestet wurde, lediglich ein verzögertes Wachstum der Teststämme beobachtet.
Die Ergebnisse der Einmischversuche 1 bis 6 zeigen auf, dass die Zellaggregatbildung von MAP bei der artifiziellen Kontamination von Rinderkot neben dem Einsatz eines geeigneten DNA-Extraktionsverfahrens entscheidend Einfluss auf die Nachweisrate der Real-Time PCR nimmt. Allein ein Vergleich der mittels Standard-DNA-Extraktionsverfahren Q der Firma Qiagen erzielten Nachweisrate der Real-Time PCR in Bezug auf die Erregerkonzentration bei den Einmischversuchen 1 bis 6 verdeutlicht den positiven Effekt einer möglichst homogenen Erregerverteilung in der Matrix Rinderkot. Während die TaqMan® Real-Time PCR in Kombination mit dem Standard-DNA-Extraktionsverfahren Q bei den Einmischversuchen 1, 2 und 3 lediglich bei einer Erregerkonzentration von ca. 104 KbE/g Rinderkot eine Nachweisrate von 100 % erzielte, konnte bei den Einmischversuchen 4, 5 und 6 bereits bei einer Erregerkonzentration von 103 KbE/g Rinderkot eine Nachweisrate von 100 % erreicht werden. In Kombination mit den modifizierten DNA-Extraktionsverfahren Qm und Rm erzielte das TaqMan® Real-Time PCR-Verfahren bei den Einmischversuchen 4, 5 und 6 sogar bei einer Erregerkonzentration von ca. 102 KbE/g Rinderkot eine Nachweisrate von 100 %. Jedoch kann die Aggregatbildung des Erregers selbst bei dem Einsatz des Middlebrook 7H9-Flüssignährmediums unter Zusatz von Tween 80 nicht vollkommen beseitigt
werden, so dass insbesondere bei niedrigen Erregerkonzentrationen Nachweisverluste von Erreger-DNA in der Real-Time PCR auftreten können. Deshalb bleibt es bei sehr niedrigen Erregerkonzentrationen von durchschnittlich 3,7 x 100 KbE/g dem Zufall überlassen, ob sich ein Erregernest in der Koteinwaage für die DNA-Isolierung befindet und es kann keine Aussage über die Leistungsfähigkeit des jeweiligen DNA-Extraktionsverfahrens bei derart niedrigen Erregergehalten getroffen werden.
In einer Studie von Bögli-Stuber et al. (2005) wurden ebenfalls artifiziell kontaminierte und native Rinderkotproben mit einem IS900-basierten Real-Time PCR-Verfahren zum Nachweis von MAP untersucht. Als Fluorophor kam bei diesem PCR-System SYBR Green zum Einsatz. Eine interne Amplifikationskontrolle zum Ausschluss falsch-negativer Ergebnisse wurde nicht mitgeführt. Bögli-Stuber et al. (2005) gelang bei der Untersuchung der artifiziell kontaminierten Rinderkotproben mit der Real-Time PCR der Nachweis einer Erregerkonzentration von 500 KbE/g Rinderkot zu 100 %.
Insgesamt wurden 7 Rinderkotproben je Verdünnungsstufe, ausgehend von einer Verdünnungsreihe, gespiked und im Doppelansatz untersucht. Bei dieser Studie erfolgte die kulturelle Anzüchtung des MAP-Stammes ATTCC 19698 für die artifizielle Kontamination der Rinderkotproben auf dem Löwenstein-Jensen-Schrägnährmedium unter Zusatz von Mycobactin J. Zur Vermeidung der Aggregatbildung des Erregers wurden Einzelkolonien des Erregers in 1 ml Middlebrook 7H9-Flüssignährmedium gerieben und mit einer kleinkalibrigen Nadel 20 x auf- und abgesaugt. Zuletzt wurde die Bakteriensuspension mit 0,5 ml einer 0,02 %igen Tween 80 Lösung versetzt, um eine erneute Aggregatbildung zu reduzieren. Auch bei diesem Einmischversuch wurde somit gezielt der Klumpenbildung entgegengewirkt und eine vergleichbare Nachweisrate in der Real-Time PCR erzielt.
d) Schlussfolgerungen
Bei den Einmischversuchen 4, 5 und 6 konnte mit den beiden modifizierten DNA-Extraktionsverfahren Qm bzw. Rm eine Nachweisrate von 100 % bei einer durchschnittlichen Erregerkonzentration von 3,7 x 102 KbE/g Rinderkot ermittelt werden. Erregerkonzentrationen von ca. 102 KbE/g Rinderkot gelten auch als Nachweisgrenze des „gold standard“, der kulturellen Anzüchtung von MAP aus Rinderkot (Merkal et al., 1968). Im Vergleich dazu lag die 100 %-Nachweisrate unter Verwendung des Protokolls der Firma Qiagen Q sowie des Standard-Protokolls der Firma Roche bei einer durchschnittlichen Erregerkonzentration von 3,7 x 103 KbE/g Rinderkot.
Aus den hier aufgezeigten Ergebnissen wird ersichtlich, dass vor allem die mechanische Aufbereitung der Fäzesproben bei der DNA-Extraktion einen positiven Effekt auf die Nachweisrate des TaqMan® Real-Time PCR-Verfahrens zum Nachweis von MAP aus Rinderkot hat. Im Vergleich der modifizierten Protokolle Qm und Rm sowie der Standard-Protokolle Q und R erzielten die
modifizierten Extraktionsverfahren niedrigere Ct-Werte in Bezug auf die jeweiligen Erregerkonzentrationen der artifiziell kontaminierten Rinderkotproben. Zusätzlich erzielte das Extraktionsverfahren der Firma Roche Rm von den beiden thermisch-chemisch-mechanischen Aufbereitungsverfahren die niedrigsten gemittelten Ct-Werte (s. Tabelle 35 sowie Abbildung 18 des Kapitels 4.2.4). Aber auch mit Hilfe der erstellten Regressionsgleichungen in Abbildung 19 des Kapitels 4.2.4 konnte der Vorteil einer mechanischen Aufreinigung der Fäzesproben bei der DNA-Isolierung von MAP aus Rinderkot deskriptiv aufgezeigt werden. Der Vergleich der exponentiellen Steigungskoeffizienten der Protokolle Q (b = 2,634), R (b = 2,754), Qm (b = 4,541) und Rm (b = 8,741), die zugleich ein Maß für die Steilheit der entsprechenden Regressionskurven der DNA-Extraktionsverfahren darstellen, verdeutlicht den positiven Einfluss einer mechanischen Aufreinigung.
Je steiler die Regressionskurven verlaufen, desto schneller wird eine 100 %ige Nachweisrate bei einer niedrigen Erregerkonzentration erreicht. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der gemittelten Ct-Werte zeigt auch die Analyse der Regressionskurven der beiden modifizierten Protokolle Qm und Rm, dass das Protokoll Rm mit einem exponentiellen Steigungskoeffizienten von b = 8,741 steiler als die Regressionskurve des Protokolls Qm mit einem exponentiellen Steigungskoeffizienten von b = 4,541 verläuft. Anhand der Regressionskurven konnte somit deskriptiv beobachtet werden, dass sich die zusätzliche mechanische Aufbereitung der Fäzesproben positiven auf die Nachweisrate der Real-Time PCR auswirkt.
Ebenso nehmen die Zellaggregatbildung von MAP, eine erhöhte Koteinwaage von 1 bis 1,5 g Rinderkot und die thermische Aufbereitung der Proben bei +95 °C für 10 Minuten der Protokolle Qm, R und Rm, die sich ihrerseits deutlich von dem Protokoll Q der Firma Qiagen mit einer Einwaage von maximal 220 mg Kot und einer thermischen Aufbereitung der Proben bei +95 °C für nur 5 Minuten abgrenzen, einen positiven Einfluss auf die Nachweisrate des TaqMan® Real-Time PCR-Verfahrens. In Abbildung 20 des Kapitels 4.2.4 konnte durch den Vergleich der Standard-Protokolle Q und R mittels logistischer Regression ein signifikanter Unterschied zwischen den Protokollen errechnet werden, der die deutliche Überlegenheit des Protokolls R gegenüber dem Protokoll Q bei der DNA-Isolierung von MAP aus Rinderkot belegt.
Abschließend bleibt festzuhalten, dass für den erfolgreichen molekularbiologischen Nachweis von MAP aus artifiziell kontaminierten Rinderkotproben eine möglichst hohe Koteinwaage, eine thermisch-chemisch-mechanische Aufbereitung der Fäzesproben sowie eine möglichst homogene Erregerverteilung, die beispielsweise durch Kultivierung der ausgewählten MAP-Stämme in dem Middlebrook 7H9-Flüssigmedium unter Zugabe von Tween 80 realisiert werden kann, von entscheidender Bedeutung sind und maßgeblich die Nachweisrate der eingesetzten PCR beeinflussen.
Um Kontaminationen mit MAP-DNA während der Aufbereitung der Rinderkotproben und damit falsch-positive Ergebnisse ausschließen zu können, sind exakte Vorgehensweisen bei der DNA-Isolierung und dem Pippetieren der PCR-Ansätze erforderlich. Deshalb ist ein kontinuierliches Probenmanagement bzw. „PCR Troubleshooting“ bei der molekularbiologischen Diagnostik notwendig und das Mitführen einer Vielzahl von Kontrollen bei jeder PCR-Aufbereitung bzw. jedem PCR-Lauf. In der vorliegenden Untersuchung wurde bei jeder PCR-Aufbereitung die DNA einer positiven und negativen Aufbereitungskontrolle eines jeweiligen Kontroll-Stammes, die Aufbereitungskontrolle des Leerwertes und ein Leerwert des Mastermixes (ohne Zugabe von Proben-DNA) mitgeführt. Zusätzlich wurde bei jedem PCR-Lauf eine Positiv- und Negativkontrolle mituntersucht. Weitere Maßnahmen in Bezug auf ein kontinuierliches Probenmanagement bzw. „PCR Troubleshooting“ sind in Kapitel 5.3.3 näher erläutert.