TBS: TBST:
2.15 Enzymaktivitätstests
2.15.1 I
2/KI-Test zur Bestimmung von Transferaktivitäten
Durch Einlagerung von Iodmolekülen in die Zuckerhelix lassen sich α-1,4-Oligo- und Polyglucane mit Lugolscher Lösung anfärben. Die Farbentwicklung beginnt bei der Maltododecaose mit einer schwachrosa Färbung. Polysaccharide mit 30 Glucosidresten sind violett (Absorptionsmaximum um 510 nm), Amylose ist mit einem Maximum bei 610-620 nm blau gefärbt (Thorn und Mohazzeb, 1990). Der I2/KI-Test wurde in zwei Varianten für die Maltosyltransferase bzw. für die 4-α-Glucano-transferase eingesetzt.
2.15.1.1 I2/KI-Test zur Bestimmung der Maltosyltransferase-Aktivität
Das Enzym wird mit einem Maltooligosaccharidgemisch, welches einen Polymerisa-tionsgrad (DP) von 4-10 besitzt, inkubiert. Durch die Transferaktivität der Maltosyl-transferase wird das Substratgemisch disproportioniert, wobei Produkte mit einem DP ≥ 12 entstehen, die sich mit Lugolscher Lösung anfärben lassen und bei 480 nm photometrisch messbar sind.
Substratlösung 2% (w/v): Maltooligosaccharide-Mixture 2 g (ICN Biochemicals, Cleveland)
H2Obidest. ad 100 ml
Lösung sterilfiltrieren.
McIlvaine-Puffer pH 6,5 (75°C): Komponente A 0,2 M Na2HPO4
Komponente B 0,1 M Zitronensäure
Komponente A mit Komponente B bei 75°C auf pH 6,5 titrieren.
I2/KI-Lösung: Lugolsche Lösung (Sigma) 1 Vol.
H2Obidest. 4 Vol.
Vor Gebrauch in einer braunen, dicht schließenden Flasche frisch ansetzen.
Testansatz: Substratlösung 200 µl McIlvaine-Puffer pH 6,5 (75°C) 100 µl
Probe + H2Obidest. 100 µl
Durchführung
- Präinkubation des Ansatz ohne Enzym für 10 min bei 75°C
- Start der Reaktion durch Zugabe von Enzym; Inkubation bei 75°C für eine definierte Zeit
- 100 µl Reaktionsansatz entnehmen und in 1 ml I2/KI-Lösung pipettieren, mischen und zügig die Extinktion bei 480 nm gegen eine Nullprobe ohne Enzym messen (Iod in verdünnter Lösung ist flüchtig und raucht relativ schnell aus)
Quantifizierung
Es handelt sich bei diesem Test um eine Gleichgewichtsreaktion, bei dem jedes Produkt gleichzeitig wieder Substrat ist. Im Verlauf der Inkubation entwickelt sich ein Gleichgewicht, welches zu einem gleichbleibenden Färbeverhalten mit Iod führt.
Allerdings findet in der Anfangsphase der Reaktion eine deutliche Verschiebung des in dem Testansatz vorliegenden Oligosaccharidgemisches von kurzkettigen zu längerkettigen (DP ≥ 12) α-1,4-Glucanen statt. In dieser initialen Phase (bis zu einer OD480 von 1,0) ist eine lineare Proportionalität zwischen Enzymaktivität und Farbintensität gegeben, die eine relative Quantifizierung erlaubt.
2.15.1.2 I2/KI-Test zur Bestimmung der 4-αααα-Glucanotransferase-Aktivität
Hier wird die 4-α-Glucanotransferase-Aktivität durch die Messung des Transfers von Glucanosylresten von einem langkettigen Donor auf Maltose als Akzeptor bestimmt.
Dabei kommt es zu einer abnehmenden Anfärbbarkeit des Testansatzes mit Iod (Liebl et al., 1992).
20 mM Tris-Cl pH 7,5 (60°C): Tris 2,42 g
H2Obidest. ad 1000 ml
Mit HCl bei 60°C auf pH 7,5 einstellen.
Substratlösung (0,05% (w/v)):Amylose 0,5 g
2 N NaOH ad 10 ml
Amylose vollständig lösen, dann
neutralisieren mit 2 M HCl und verdünnen
mit 20 mM Tris-Cl, pH 7,5 (60°C) ad 1000 ml
Maltoselösung: Maltose 2 g
H2Obidest. ad 100 ml
I2/KI-Lösung (0,02 % (v/v)): Lugolsche Lösung 1 Vol.
H2Obidest. 49 Vol.
Vor Gebrauch in einer braunen, dicht schließenden Flasche frisch ansetzen.
Testansatz: Maltoselösung 25 µl
Probe x µl
Substratlösung ad 1000 µl
Durchführung
- Testansatz mischen und bei 60°C inkubieren.
- Zu den Zeitpunkten t 0 min und t 15 min je 100 µl entnehmen und in 1 ml I2/KI-Lösung (0,02 % (v/v)) pipettieren.
- Messung der OD bei 620 nm gegen H2Obidest. und Bildung der Differenz ∆E620
zwischen den Extinktionen E620 (t 0 min) und E620 (t 15 min).
Quantifizierung
Für diesen Test gelten ähnliche Einschränkungen wie für den Maltosyltransferase-Aktivitätstest, für ein ∆E620 von 0,1 - 0,5 besteht aber auch hier eine lineare Beziehung zur Enzymaktivität, so daß zumindest eine relative Quantifizierung möglich ist. Unitdefinition: 1 U = ∆E620 pro 15 min.
2.15.2 Hydrolyse von para-Nitrophenyl-Substraten
Para-Nitrophenyl (pNP)-Glycoside sind synthetische Testsubstrate für hydrolytische Enzyme. Durch die enzymatische Spaltung der arylglycosidischen Bindung wird p-Nitrophenol freigesetzt, das sich durch seine gelbe Färbung photometrisch bei 420 nm bestimmen läßt:
p-Nitrophenyl-Glycosid p-Nitrophenol + Zucker
(farblos) (gelb)
Testansatz:
Probe x µl
Tris-Cl pH 7(60°C): 0,5 M 30 µl
MnCl2: 10 mM 30 µl
NAD+: 9 mM (Lagerung bei 4°C) 30 µl Dithiothreitiol (DTT):1 M (Lagerung bei 4°C) 15 µl
H2Obidest.: 185 – x µl
Durchführung:
- 5 min Präinkubation des Testansatzes bei 60°C.
- Start durch Zugabe von 10 µl p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (0,1 M in DMSO, Lagerung bei -20°C) und Inkubation bei 60°C für eine definierte Zeit (Gelbfärbung).
- Abstoppen auf Eis durch Zugabe von 20 µl EDTA (0,5 M; pH 8,0) und Farbintensivierung durch Alkalisierung.
- Zugabe von 680 µl H2Obidest. und Bestimmung der Extinktion bei 420 nm gegen eine Negativkontrolle ohne Enzym.
Abb. 7: Eichgerade für den pNP-α-D-glucosid-Test. Die Eichgerade wurde unter Testbedingungen mit einer 2,5 mM p-Nitrophenol-Standardlösung im Bereich von 0-150 nmol p-Nitrophenol durchgeführt (→ Der molare Extinktions-Koeffizient von pNP unter diesen Bedingungen ist 12000 M-1cm-1).
y = 0 , 0 1 2 x
E i c h f a k t o r : 8 3 , 3 3
0 1 2
0 5 0 1 0 0 1 5 0
p N P [ n m o l ] OD420
Quantifizierung
Durch Multiplikation des erhaltenen Extinktionswertes mit dem reziproken Wert des ermittelten Steigungsfaktors erhält man die Menge an p-Nitrophenol (in µmol), die im Test freigesetzt wurde. Eine Unit entspricht der Enzymaktivität, die 1 µmol p-Nitro-phenol in 1 min freisetzt.
2.15.3 Enzymaktivitätstest auf Agarplatten
Zur Identifizierung α-Glucosidase positiver Klone nach der Transformation wurde das künstliche Substrat 4-Methylumbelliferyl-α-D-glucosid verwendet, dessen Hydrolyse-produkt 4-Methylumbelliferon durch Fluoreszenz bei 366 nm nachgewiesen werden kann.
Inkubationslösung: 0,5 M Tris-Cl pH 7(60°C) 50 µl
10 mM MnCl2 50 µl
9 mM NAD+ 50 µl
1 M DTT 25 µl
0,1 M MU-α-D-glucosid (in DMSO) 25 µl
H2Obidest. 300 µl
Durchführung
- Strichförmiges Animpfen der Transformanten auf LB-Agarplatten und Inkubation (unter Selektionsdruck) bei 37°C über Nacht.
- Präinkubation der Aktivitätsplatte bei 60 °C im Wasserbad/Trockenschrank.
- Auflegen eines mit Inkubationslösung getränkten Membranfilters und weitere Inkubation bei 60°C (15 min).
- Detektion positiver Klone unter UV-Licht (366 nm).
2.15.4 DNSA-Test zur Bestimmung reduzierender Zucker
Bei der Hydrolyse polymerer Zucker werden kleinere Bruchstücke bzw. Monomere gebildet, wodurch sich die Zahl der reduzierenden Enden vervielfacht. In Gegenwart von Phenol und Natriumsulfit wird DNSA durch freie Halbacetalgruppen zur 3-Amino-5-nitrosalicylsäure reduziert. Diese Reaktion bedingt eine zunehmende Braunfärbung des Testansatzes, die proportional zur Anzahl an reduzierenden Enden ist und photometrisch bei 575 nm quantifiziert werden kann.
3,5-Dinitrosalicylsäure 100°C, 15 min 3-Amino-5-nitrosalicylsäure
(gelb) Phenol, Na2SO3 (braun)
DNSA-Reagenz: Dinitrosalicylsäure 10 g
Phenol 2 g
Na2SO3 0,5 g
K-Na-Tartrat 200 g
NaOH 10 g
H2Obidest. ad 1000 ml
McIlvaine, pH 6,5 (75°C): Komponente A 0,2 M Na2HPO4
Komponente B 0,1 M Zitronensäure
Komponente A mit Komponente B bei 75°C auf pH 6,5 titrieren
Substratlösung: lösliche Substrate 1% (w/v) in H2Obidest.
unlösliche Substrate 2% (w/v) in H2Obidest.
Testansatz:
- lösliche Substrate Substratlösung (1% (w/v)) 250 µl
McIlvaine, pH 6,5 (75°C) 100 µl
Probe + H2Obidest. 150 µl
- unlösliche Substrate Substratlösung (2 % (w/v)) 375 µl
McIlvaine, pH 6,5 (75°C) 150 µl
Probe + H2Obidest. 225 µl
Durchführung
- Präinkubation des Testansatzes ohne Enzym für 10 min bei 75°C.
- Start der Reaktion durch Zugabe von Enzym; Inkubation für eine definierte Zeit bei 75°C.
- bei unlöslichen Substraten: Substrat abzentrifugieren, 500 µl Überstand entneh-men und in ein neues E-Cup überführen.
- Reaktion durch Zugabe von 750 µl DNSA-Reagenz abstoppen.
- Ansatz 15 min bei 100°C inkubieren, anschließend auf Eis abkühlen.
- OD bei 575 nm gegen eine Nullprobe ohne Enzym messen.
Quantifizierung
Zur Quantifizierung der hydrolytischen Aktivität wird für jedes polymere Substrat eine Eichgerade mit variablen Mengen des entsprechenden Monomers (für Glucane also eine Eichgerade mit Glucose) unter Testbedingungen erstellt. 1 Unit entspricht der Enzymaktivität, die 1 µmol reduzierende Enden (Glucose-Äquivalente) in 1 min erzeugt.