3.4.1 ELISA allgemein
Der enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) gehört zusammen mit dem Radioimmunoassay (RIA) zu den Immunoassays. Er dient dem Nachweis und der quantitativen Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern durch ihre spezifischen Antikörper oder Antigene. Beide gehören zu den Festphasenassays, deren Charakteristikum die Bindung einer Komponente an einer Kunststoffoberfläche ist, und die fast gleichzeitig und unabhängig voneinander von ENGVALL u. PERLMANN (1971) sowie von VAN WEEMEN u. SCHUURS (1971) beschrieben wurden. Dem ELISA vorausgegangen ist der RIA, der erstmalig 1960 von YALOW und BERSON beschrieben worden war. Nachteil des RIA gegenüber dem ELISA ist die potentiell hohe Gesundheitsbelastung, da hier eine bekannte Menge des nachzuweisenden Antigens radioaktiv markiert und an ihre spezifischen Antikörper gebunden wird. Im Folgeschritt wird die Probe mit der zu bestimmenden unbekannten Menge an Antigen dazu gegeben, welches nun mit dem radioaktiv markierten Antigen um die gleichen Bindungsstellen konkurriert und zu einer teilweisen Verdrängung derselbigen führt. Die gemessene Radioaktivität im Überstand ist nun proportional mit der Menge des nachzuweisenden Antigens. Für den Anwender besteht beim ELISA – durch den Verzicht auf radioaktiv markierte Antigene und die Nutzung einer enzymgekoppelten Farbreaktion – eine geringere Gesundheitsbelastung. Weiterhin ist das Verfahren preiswerter und die Detektion der Farbreaktion einfacher.
Das ELISA-Prinzip funktioniert wie folgt: Ein Markermolekül, das heißt in diesem Fall ein Enzym, bindet über einen spezifischen Antikörper das nachzuweisende Antigen.
Ein zugegebenes Substrat wird durch das Enzym umgesetzt und zeigt eine sichtbare Farbreaktion.
Dieses Grundprinzip wurde den jeweiligen Bedingungen angepasst, sodass es verschiedene ELISA-Systeme zu unterscheiden gibt. So gibt es direkte und indirekte ELISA. Beim direkten ELISA ist schon der das Antigen bindende spezifische Antikörper enzymgekoppelt, während beim indirekten ELISA das Enzym mit einem Sekundärantikörper verbunden ist, welcher gegen den primären Antikörper gerichtet ist, der das zu detektierende Antigen bindet. Beide Systeme haben gewisse Vorteile:
Während es beim direkten ELISA durch den Wegfall eines weiteren Inkubationsschritts zu einer deutlichen Zeitersparnis kommt, hat der indirekte ELISA den Vorteil, dass hier eine Signalverstärkung über die Bindung mehrerer enzymgekoppelter Sekundärantikörper an den Primärantikörper möglich ist.
Weiterhin gibt es kompetitive und nichtkompetitive ELISA-Systeme. Beim kompetitiven ELISA konkurrieren der zu messende Analyt und eine bekannte Menge eines enzymgekoppelten Antigens um die gleiche Bindungsstelle eines spezifischen Antikörpers, der an die Festphase gebunden ist. Je mehr Analyt in der Probe vorliegt, desto weniger enzymgekoppeltes Antigen kann binden und Substrat umsetzten. Die gemessene Farbintensität ist also umgekehrt proportional zur Menge des Analyten.
Der sogenannte Sandwich-ELISA stellt den sehr häufig genutzten nichtkompetitiven ELISA dar. Bei diesem ELISA ist das zu detektierende Antigen von zwei spezifischen Antikörpern eingerahmt. Der Fängerantikörper ist hier an die Festphase gebunden und bindet als erstes das zu messende Antigen. Im Folgeschritt bindet ein enzymgekoppelter Detektorantikörper das Antigen an einen anderen Epitop. Somit ist diese Form des ELISAs erst ab einer bestimmten Größe des Analyten und beim Vorhandensein unterschiedlicher Epitope möglich. Beim nicht kompetitiven ELISA ist die gemessene Farbreaktion proportional zur gebundenen Menge an Antigen.
Im Folgenden soll beispielhaft auf die einzelnen Teilschritte des Sandwich-ELISA‘s eingegangen werden. Im ersten Schritt wird ein spezifischer Antikörper auf einer Festphase gebunden. Die Bindung kommt durch physikalische Wechselwirkungen des Antikörpers mit der Kunststoffoberfläche, meistens einer
Polystyren-Mikrotiterplatte, zustande. Nach der Inkubationszeit ist es wichtig den Inhalt der einzelnen Wells zu entfernen und die Wells mit einer Waschlösung von nicht gebundenen Antikörpern zu befreien. Da es häufig auch nach dem Waschen noch Bereiche auf der Mikrotiterplatte gibt, die weitere Proteine binden können, werden diese durch die Zugabe eines unspezifischen Proteins, z. B. bovines Serumalbumin, geblockt. Bei den meisten kommerziellen ELISA-Systemen erhält man die Mikrotiterplatten bereits beschichtet und geblockt. Somit ist das Aufbringen der Proben in der Regel der erste Schritt. Die in der Probe beinhalteten Antigene binden über Wasserstoffbrückenbindung, Ionenbindung, hydrophobe Interaktionen und van-der-Waals-Kräfte an die an der Mikrotiterplatte immobilisierten Antikörper. Nach der Inkubationszeit werden überschüssige Reaktionspartner mittels einer Waschlösung aus den Kavitäten entfernt. Danach werden enzymgekoppelte Detektorantikörper in die Wells pipettiert. Diese binden an ein anderes Epitop als der Fängerantikörper. Als Enzym wird häufig eine Peroxidase, z. B. eine Meerrettichperoxidase, eingesetzt. Es schließen eine Inkubationspause sowie ein Waschschritt zur Beseitigung überschüssiger Antikörper an. Abhängig vom gewählten Enzym muss das passende Substrat und Chromogen gewählt werden. Wasserstoffperoxid wird der Meerrettichperoxidase als Substrat angeboten. Die bei der Reaktion freiwerdenden Protonen oxidieren nun das bisher fast farblose Chromogen Tetramethylbenzidin zu einem blauen Endprodukt. Durch die Zugabe von Säure lässt sich die Reaktion beenden und das Blau in ein stabiles Gelb umschlagen. Diese Farbreaktion, die proportional zur Menge des gebundenen Antigens erfolgt, lässt sich nun photometrisch in einer Optischen Dichte ausdrücken. Die Wellenlänge, bei welcher gemessen wird, hängt vom Chromogen ab. Bei Tetramethylbenzidin liegt sie bei 450 nm (RAEM u. RAUCH 2007).
Die genutzten Antikörper sind entweder monoklonaler oder polyklonaler Natur. Das Charakteristikum der monoklonalen Antikörper ist, dass sie alle von einer Zellpopulation gebildet wurden, die von einem einzigen B-Lymphozyten stammt.
Monoklonale Antikörper richten sich gegen ein einziges Epitop eines Proteins.
Polyklonale Antikörper dagegen leiten sich von verschiedenen B-Lymphozyten ab.
Sie richten sich alle gegen das gleiche Protein, binden aber an verschiedene Epitope.
3.4.2 Prinzip des ELISA zur Bestimmung von IL-6/TGF-β1
Bei den Testsystemen „Quantikine Canine IL-6 Immunoassay“ (Fa. R & D systems, Minneapolis) und “Quantikine Human TGF-β1 Immunoassay“ (Fa. R & D systems, Minneapolis) handelt es sich um Sandwich-ELISA. Beide folgen dem gleichen Prinzip. Eine Mikrotiterplatte ist mit Antikörpern beschichtet. Im Falle des „Quantikine Canine IL-6 Immunoassay“ handelt es sich um einen polyklonalen Antikörper, der spezifisch für canines IL-6 ist und beim “Quantikine Human TGF-β1 Immunoassay“
um einen monoklonalen Antikörper der spezifisch für TGF-β1 ist. Im ersten Schritt werden Standards, Kontrollen und Proben in die Wells pipettiert. Vorhandenes IL-6 bzw. TGF-β1 wird nun im entsprechenden Testsystem an die immobilisierten Antikörper gebunden. Es folgt ein Waschschritt, bei dem alles ungebundene Material entfernt wird. In der Folge wird ein jeweils enzymgekoppelter polyklonaler Antikörper, der spezifisch für das bereits im ersten Schritt immobilisierte IL-6 bzw. TGF-β1 ist, hinzugegeben. Der nachzuweisende Analyt wird nun von beiden Seiten von Antikörpern eingerahmt. Nach einem weiteren Waschschritt, bei dem nicht gebundene enzymgekoppelte Antiköper entfernt werden, wird eine Substrat-Lösung in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben. Die an den Antikörper gekoppelte Meerrettichperoxidase reagiert mit dem Substrat. Es entsteht der blaue Farbstoff Tetramethylbenzidin. Seine Menge ist proportional zur Menge des im ersten Schritt gebundenen Analyten. Die Farbentstehung wird durch Zugabe von Salzsäure gestoppt. Die blaue Farbe schlägt dabei nach Gelb um.