3.6.1 Testdurchführung „Quantikine Canine IL-6 Immunoassay“
Zunächst werden alle Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht. Daraufhin werden die Positivkontrolle, die Waschlösung, die Substratlösung sowie der Standard vorbereitet. Die lyophilisierte Kontrolle wird mit 1 ml deionisiertem Wasser rekonstituiert. 25 ml des Waschlösungskonzentrates werden mit 600 ml deionisiertem Wasser vermischt. Der lyophilisierte Standard wird mit 5 ml Calibrator Diluent RD5T rekonstituiert. Es entsteht eine Stammlösung mit einer Konzentration von 2000 mg/ml. Aus dieser Stammlösung wird eine 2-fache Verdünnungsreihe hergestellt. Dazu werden in 6 Reagiergefäßen jeweils 300 µl Calibrator Diluent RD5T vorgelegt. In das erste Reagiergefäß werden 300 µl der Stammlösung gegeben und gründlich vermischt. Aus diesem Gemisch werden wiederum 300 µl Lösung in das nächste Gefäß pipettiert usw. So entsteht eine Verdünnungsreihe mit den Konzentrationen 1000/500/250/125/62,5/31,25 pg/ml. Der unverdünnte canine IL-6-Standard dient als höchster IL-6-Standard mit 2000 pg/ml, der Calibrator Diluent RD5T dient als Nullprobe mit 0 pg/ml.
Nach der Beendigung der Vorbereitungen kann mit dem eigentlichen Test begonnen werden. In jedes Well der Mikrotiterplatte werden 50 µl des Assay Diluenten RD1-75 vorgelegt. Im folgendem werden jeweils 100 µl Standard, Kontrolle und Proben in die Wells pipettiert und die Platte mit einer selbstklebenden Folie abgedeckt. Es folgt eine zweistündige Inkubationsphase bei Raumtemperatur auf einer Rüttelplatte Titertek® (Fa. Flow Laboratories, Irvine, Schottland) bei 500±50 rpm. Anschließend
folgt ein Waschschritt. Der Inhalt der Wells wird ausgeschüttet und die Wells mit 400 µl Waschlösung befüllt. Die Befüllung erfolgt mittels des Nunc-Immuno ™wash 8 (Fa.
NUNC, Wiesbaden). Dabei ist besonders darauf zu achten, dass nach jedem Waschschritt die Waschlösung gut entfernt wird. Dazu wird die Mikrotiterplatte nach dem Entfernen der Waschlösung auf ein sauberes Papiertuch geklopft. Der Waschschritt wird insgesamt vier Mal wiederholt. Im Anschluss werden in jedes Well 200 µl canines IL-6-Konjugat pipettiert. Die Mikrotiterplatte wird mit einer neuen selbstklebenden Folie abgedeckt und erneut für zwei Stunden auf die Rüttelplatte verbracht. Es folgen wieder fünf Waschschritte. Daraufhin werden 120 µl Substratlösung in jedes Well verbracht. Die Substratlösung besteht aus zwei Komponenten, die zu gleichen Teilen vermischt werden. Die Anwendung der Substratlösung muss innerhalb von 15 Minuten nach deren Ansatz erfolgen. Die Mikrotiterplatte wird erneut mit einer frischen selbstklebenden Folie abgedichtet. Die folgende 45-minütige Inkubationszeit muss vor Licht geschützt stattfinden. Nach Ablauf der 45 Minuten wird die Farbreaktion durch die Zugabe von 120 µl Stopplösung je Well unterbrochen. Die Messung der optischen Dichte soll innerhalb von 30 Minuten nach Abstoppen der Farbreaktion erfolgen. Die Messung erfolgte mit dem TECAN GENios Pro (Fa. TECAN Austria GmbH, Grödig, Österreich) bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Korrekturwellenlänge von 570 nm.
3.6.2 Testdurchführung des “Quantikine Human TGF-β1 Immunoassay“
Zunächst müssen einige Reagenzien vorbereitet werden. Dazu werden alle Reagenzien auf Raumtemperatur erwärmt. 25 ml der Waschpufferlösung werden mit 600 ml deionisiertem Wasser angesetzt. Die einsatzfertige Mischung des Calibrator Diluent RD5-53 entsteht durch die Zugabe von 20 ml Calibrator Diluent RD5-53-Konzentrat zu 60 ml deionisiertem Wasser. Als nächstes müssen der Standard und die Verdünnungsreihe angesetzt werden. Der lyophilisierte Standard wird mit 2 ml Calibrator Diluent RD5-53 rekonstituiert. So entsteht eine Stammlösung mit einer Konzentration von 2000 pg/ml. Nachdem der Standard fünf Minuten geruht und nochmal gut mit dem Vortexer Vortex-Genie 2 (Fa. Scientific Industries, New York)
durchgemischt wurde, wird die 2-fache Verdünnungsreihe hergestellt. Dazu werden sechs 1,5 ml Reagiergefäße (Fa. Sarstedt AG & Co, Nümbrecht) mit jeweils 200 µl Calibrator Diluent RD5-53 bestückt. Nun werden 200 µl des TGF-β1-Standards mit 2000 pg/ml in das erste Reagiergefäß gegeben und gut durchmischt. Aus dieser ersten Mischung werden nun wieder 200 µl entnommen, in das zweite Reagiergefäß gegeben und gut durchmischt. Diese Schritte werden mit den übrigen Reagiergefäßen genauso wiederholt. So entsteht eine Verdünnungsreihe mit den β1-Konzentrationen 1000/500/250/125/62,5/31,25 pg/ml. Der unverdünnte TGF-β1-Standard mit 2000 pg/ml dient als höchster Standard, der Calibrator Diluent RD5-53 wird als Negativkontrolle mit 0 pg/ml genutzt.
Um das immunoreaktive TGF-β1 zu messen ist es notwendig, das latente TGF-β1 zu aktivieren. Dazu werden die Proben auf Raumtemperatur gebracht und 40 µl Serum oder Plasma in ein 1,5 ml Reagiergefäß (Fa. Sarstedt AG & Co, Nümbrecht) verbracht. Im Anschluss werden 20 µl 1 N HCl dazugegeben, mittels eines Vortexers Vortex-Genie 2 (Fa. Scientific Industries, New York) gut gemischt und zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wird die Probe durch die Zugabe von 20 µl 1.2 N NaOH/ 0,5M HEPES neutralisiert und wieder gevortextet. Es folgt für die Serumproben eine 20-fache Verdünnung. Dazu werden 10 µl aktivierte Probe mit 190 µl Calibrator Diluent RD5-53 vermischt. Die Plasmaproben dagegen werden nur einer 2-fachen Verdünnung unterzogen. In diesem Fall werden 80 µl aktivierte Probe mit 80 µl Calibrator Diluent RD5-53 verdünnt. Nun können die Serum- und Plasmaproben gemessen werden.
Für die Messung werden 50 µl Assay Diluent RD1-73 in alle Wells pipettiert. Im Anschluss werden die Standards, die Negativkontrolle und die aktivierten und verdünnten Proben in die Wells pipettiert. Die Mikrotiterplatte wird mit einer selbstklebenden Folie bedeckt, sanft geschwenkt, um eine Durchmischung der Lösungen zu gewährleisten, und anschließend für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nun folgt ein Waschschritt. Dabei wird zunächst der Inhalt der Wells entfernt und im Anschluss durch 400 µl Waschpufferlösung aus dem Nunc-Immuno
™wash 8 (Fa. NUNC, Wiesbaden) ersetzt. Die Waschlösung wird wieder
ausgeschüttet und die Mikrotiterplatte durch sanftes Schlagen auf ein sauberes Papierhandtuch von Resten der Waschlösung befreit. Dieser Schritt wird dreimal wiederholt. Im Anschluss werden 100 µl TGF-β1-Konjugat in jedes Well pipettiert. Die Mikrotiterplatte wird mit einer neuen selbstklebenden Folie versehen. Es folgt eine zweistündige Inkubationszeit bei Raumtemperatur. Nach Ablauf der zwei Stunden wird die Platte wieder viermal mit Waschpuffer-Lösung gewaschen. Daraufhin werden 100 µl Substratlösung in jedes Well pipettiert, die zu gleichen Teilen diese Lösung bilden. Sie soll innerhalb von 15 Minuten nach Mischung beider Komponenten verbraucht werden. Nach dem Bekleben der Mikrotiterplatte mit der Folie folgt eine 45-minütige Inkubationszeit, in der die Mikrotiterplatte vor Lichteinfall geschützt werden muss. Nach Ablauf dieser Zeit werden 100 µl Stopplösung in alle Wells pipettiert, um die Farbreaktion zu beenden. Es folgt das Ablesen der optischen Dichte durch den ELISA-Reader innerhalb von 30 Minuten nach Abstoppen der Farbreaktion. Dies erfolgte mit dem TECAN GENios Pro (Fa. TECAN Austria GmbH, Grödig, Österreich) bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Korrekturwellenlänge von 570 nm.