ELISA zum Nachweis von Antikörpern gegen das Peptid rSyb2 70-76

4. ERGEBNISSE

4.2 Untersuchungen zur Wirksamkeit der Adjuvantien

4.2.1 ELISA zum Nachweis von Antikörpern gegen das Peptid rSyb2 70-76

konnte ein Anstieg der Antikörperproduktion jedoch nur in den Verdünnungen 1:5 und 1:10 gesehen werden. Nach der zweiten Boosterung kam es in jeder Verdünnungsstufe zu einer weiteren Verstärkung der Antikörperbildung.

b) Tiergruppen mit dem Carrier ChTxB (Abbildung 11a-c):

Gruppe 3 (PBS) zeigte nach der ersten Immunisierung und der ersten Boosterung eine schwache Antikörperproduktion in den Verdünnungsstufen 1:2-1:10, die in der Verdünnung 1:30 stark abfiel. Nach der zweiten Boosterung fand in den Verdünnungsstufen 1:5 und 1:10 ein Abfall in der Antikörperbildung statt. Ab einer Verdünnung von 1:30 befanden sich die Extinktionswerte im Bereich der Kontrollgruppe.

Bei Gruppe 7 (Specol) war nach der Erstimmunisierung ein geringer Anstieg der Serumantikörper im ELISA festzustellen, der allerdings schon bei Verdünnung 1:10 stark absank und bei Verdünnungsstufe 1:30 im Wertebereich der Kontrollgruppe lag. Nach der ersten Boosterung war eine etwas stärkere Reaktion im ELISA zu beobachten, die sich bis zur Verdünnung 1:30 hielt. Ab Verdünnung 1:100 lagen die Extinktionen dann im Wertebereich der Kontrollgruppe. Die Extinktionswerte nach der zweiten Boosterung unterschieden sich nur unwesentlich von denen nach der ersten Boosterung.

Bei Gruppe 8 (ImmunEasy™) konnte nach der ersten Immunisierung eine mäßige Antikörperproduktion festgestellt werden. Nach der ersten Boosterung wurde ein messbarer Anstieg der Antikörperbildung beobachtet, der mit fortschreitender Verdünnungsstufe langsam sank. Nach der zweiten Boosterung kam es zu einem Abfall der Antikörpertiter in den Verdünnungen 1:5 bis 1:30. Ab Verdünnungsstufe 1:100 lagen die gemessenen Extinktionswerte im Bereich der Kontrollgruppe.

Bei Gruppe 9 (AdjuPrime™) konnte nach der ersten Immunisierung und der ersten Boosterung in den Verdünnungen 1:2, 1:5 und 1:10 eine geringe Antikörperbildung gemessen werden. Die Extinktionswerte für die Verdünnung 1:30 lagen jedoch bereits wieder im Bereich der Kontrollgruppe. Nach der zweiten Boosterung konnte man in den Verdünnungen 1:5 und 1:10 eine geringe Verstärkung der Antikörperbildung sehen. Die Extinktionswerte für die folgenden Verdünnungen lagen wiederum im Bereich der Kontrollgruppe.

Gruppe 10 (Algen-LPS-Öladjuvans), 11 (Imject^® Alum) und 12 (Diluvac forte) zeigten nach der Erstimmunisierung in der Verdünnung 1:2 eine sehr geringe Antikörperbildung.

Bei den Gruppen 10 und 11 fielen die Werte bei Verdünnung 1:10 wieder ab, bei Gruppe 12 geschah dies jedoch schon in der Verdünnungsstufe 1:5. Aus diesem Grund kann man der Gruppe 12 keine signifikante Antikörperproduktion zuschreiben. Gruppe 10, 11 und 12 wiesen nach der ersten und zweiten Boosterung in den Verdünnungen 1:5 und 1:10 eine leichte Antikörperproduktion im ELISA auf, die jedoch schon ab der Verdünnungsstufe 1:30 im Wertebereich der Kontrollgruppe lag. In den Gruppen 10-12 wurde demnach keine signifikante Antikörperproduktion festgestellt.

c) Oral immunisierte Tiergruppen (Abbildung 12a-c)

Die oral immunisierten Gruppen 13 (PBS) und 14 (ImmunEasy™) ließen nach der ersten Boosterung in den Verdünnungen 1:2 und 1:5 eine geringe Antikörperproduktion im ELISA erkennen. In den folgenden Verdünnungsstufen lagen die Extinktionswerte jedoch im Bereich der Kontrollgruppe, so dass hier keine signifikante Antikörperbildung stattfand.

Nach der dritten und fünften Boosterung konnte in den Gruppen 13 und 14 keine Antikörperproduktion nachgewiesen werden. Die Extinktionswerte lagen bei jeder Verdünnungsstufe nahe bei denen der Gruppe 0.

Abbildung 10a-c: ELISAs zur Bestimmung des zeitlichen Verlaufs der Antikörpertiter gegen rSyb270-76 der einzelnen Gruppen mit dem Carrier KLH in Abhängigkeit vom Adjuvans für die Immunisierung, die erste und zweite Boosterung (Serenverdünnung für die Immunisierung 1:2, 1:5, 1:10 und 1:30, für die erste Boosterung 1:5, 1:10, 1:30, 1:100, 1:300 und 1:1000 und für die zweite Boosterung 1:5, 1:10, 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000 und 1:3000, Coating-Antigen rSyb270-76 0,5 µg je well in 50 µl PBS). Die Tiergruppen werden nach Carrier getrennt aufgeführt. Die oral immunisierten Gruppen werden gesondert betrachtet, da sie im Gegensatz zu den subkutan immunisierten Gruppen alle 14 Tage geboostert wurden.

Diagramme der Tiergruppen mit dem Carrier KLH:

Verdünnung der Mäusepoolseren

rSyb2(70-76)-Ak(OD 450nm)

1:5 1:10 1:30 1:100 1:300 1:1000

0 0.5 1.0 1.5

2.0 Kontrolle

KLH-rSyb2(70-76)+PBS KLH-rSyb2(70-76)+Specol KLH-rSyb2(70-76)+ImmunEasy KLH-rSyb2(70-76)+AdjuPrime KLH-rSyb2(70-76)+Algen-LPS

Verdünnung der Mäusepoolseren

rSyb2(70-76)-Ak(OD 450nm)

1:2 1:5 1:10 1:30

0 0.5 1.0 1.5

2.0 Kontrolle

KLH-rSyb2(70-76)+PBS KLH-rSyb2(70-76)+Specol KLH-rSyb2(70-76)+ImmunEasy KLH-rSyb2(70-76)+AdjuPrime KLH-rSyb2(70-76)+Algen-LPS

Abbildung 10a: Immunisierung (Tag 0) Abbildung 10b: 1. Boosterung (Tag 28)

Verdünnung der Mäusepoolseren

rSyb2(70-76)-Ak(OD 450nm)

1:5 1:10 1:30 1:100 1:300 1:1000 1:3000

0 0.5 1.0 1.5

2.0 Kontrolle

KLH-rSyb2(70-76)+PBS KLH-rSyb2(70-76)+Specol KLH-rSyb2(70-76)+ImmunEasy KLH-rSyb2(70-76)+AdjuPrime KLH-rSyb2(70-76)+Algen-LPS

Abbildung 10c: 2. Boosterung (Tag 56)

Abbildung 11a-c: ELISAs zur Bestimmung des zeitlichen Verlaufs der Antikörpertiter gegen rSyb270-76 der einzelnen Gruppen mit dem Carrier ChTxB in Abhängigkeit vom Adjuvans für die Immunisierung, die erste und zweite Boosterung (Serenverdünnung für die Immunisierung 1:2, 1:5, 1:10 und 1:30, für die erste Boosterung 1:5, 1:10, 1:30, 1:100, und 1:300 und für die zweite Boosterung 1:5, 1:10, 1:30, 1:100, 1:300 und 1:1000, Coating-Antigen rSyb270-76 0,5 µg je well in 50 µl PBS). Die Tiergruppen werden nach Carrier getrennt aufgeführt. Die oral immunisierten Gruppen werden gesondert betrachtet, da sie im Gegensatz zu den subkutan immunisierten Gruppen alle 14 Tage geboostert wurden.

Diagramme der Tiergruppen mit dem Carrier ChTxB:

Verdünnung der Mäusepoolseren

rSyb2(70-76)-Ak(OD 450nm)

1:2 1:5 1:10 1:30

0 0.5 1.0 1.5

2.0 Kontrolle

ChTxB-rSyb2(70-76)+PBS ChTxB-rSyb2(70-76)+Specol ChTxB-rSyb2(70-76)+ImmunEasy ChTxB-rSyb2(70-76)+AdjuPrime ChTxB-rSyb2(70-76)+Algen-LPS ChTxB-rSyb2(70-76)+AL(OH)3 ChTxB-rSyb2(70-76)+Diluvac

Verdünnung der Mäusepoolseren

rSyb2(70-76)-Ak(OD 450nm)

1:5 1:10 1:30 1:100 1:300

0 0.5 1.0 1.5

2.0 Kontrolle

ChTxB-rSyb2(70-76)+PBS ChTxB-rSyb2(70-76)+Specol ChTxB-rSyb2(70-76)+ImmunEasy ChTxB-rSyb2(70-76)+AdjuPrime ChTxB-rSyb2(70-76)+Algen-LPS ChTxB-rSyb2(70-76)+AL(OH)3 ChTxB-rSyb2(70-76)+Diluvac

Abbildung 11a: Immunisierung (Tag 0) Abbildung 11b: 1. Boosterung (Tag 28)

rSyb2(70-76)-Ak(OD 450nm)

0.5 1.0 1.5

2.0 Kontrolle

ChTxB-rSyb2(70-76)+PBS ChTxB-rSyb2(70-76)+Specol ChTxB-rSyb2(70-76)+ImmunEasy ChTxB-rSyb2(70-76)+AdjuPrime ChTxB-rSyb2(70-76)+Algen-LPS ChTxB-rSyb2(70-76)+AL(OH)3 ChTxB-rSyb2(70-76)+Diluvac

Abbildung 12a-c: ELISAs zur Bestimmung des zeitlichen Verlaufs der Antikörpertiter gegen rSyb270-76 der oral immunisierten Gruppen in Abhängigkeit vom Adjuvans für die Immunisierung, die dritte und fünfte Boosterung (die oral immunisierten Gruppen werden alle 14 Tage geboostert), (Serenverdünnung für die Immunisierung 1:2, 1:5, 1:10 und 1:30, für die dritte Boosterung 1:5, 1:10, 1:30, 1:100 und 1:300 und für die fünfte Boosterung 1:5, 1:10, 1:30, 1:100, 1:300 und 1:1000, Coating-Antigen rSyb270-76 0,5 µg je well in 50 µl PBS).

Diagramme der oral immunisierten Tiergruppen:

Verdünnung der Mäusepoolseren

rSyb2(70-76)-Ak(OD 450nm)

1:2 1:5 1:10 1:30

0 0.5 1.0 1.5

2.0 Kontrolle

ChTxB-rSyb2(70-76)+PBS (oral) ChTxB-rSyb2(70-76)+ImmunEasy (oral)

Verdünnung der Mäusepoolseren

rSyb2(70-76)-Ak(OD 450nm)

1:5 1:10 1:30 1:100 1:300

0 0.5 1.0 1.5

2.0 Kontrolle

ChTxB-rSyb2(70-76)+PBS (oral) ChTxB-rSyb2(70-76)+ImmunEasy (oral)

Abbildung 12a: Immunisierung (Tag 0) Abbildung 12b: 3. Boosterung (Tag 42)

Verdünnung der Mäusepoolseren

rSyb2(70-76)-Ak(OD 450nm)

1:5 1:10 1:30 1:100 1:300 1:1000

0 0.5 1.0 1.5

2.0 Kontrolle

ChTxB-rSyb2(70-76)+PBS (oral) ChTxB-rSyb2(70-76)+ImmunEasy (oral)

Abbildung 12c: 5. Boosterung (Tag 72)

Anhand der Abbildungen wird ersichtlich, dass sich die Messwerte für die Gruppen 2 und 4 vom Extinktionsverlauf der Kontrollgruppe deutlich unterscheiden. Im Rahmen einer statistischen Untersuchung mit einem „repeated measurement model“ wurden sowohl die unterschiedlichen Zeitprofile (p = 0,006) als auch Unterschiede in den globalen Mittelwerten zwischen den Gruppen (p< 0,0001) betrachtet. Vergleiche der einzelnen Adjuvantien mit der Kontrolle wiesen lediglich für die beiden oben genannten Tiergruppen auf statistisch relevante Unterschiede zur Kontrolle hin (jeweils padjustiert < 0,0001, Dunnett-Test). Alle anderen Adjuvansgruppen zeigten zwar - verglichen mit der Kontrolle - geringfügige Unterschiede im Extinktionsverlauf, diese erwiesen sich aber nicht als statistisch signifikant.

Um einen Vergleich der Antikörperproduktion der unterschiedlich immunisierten und geboosterten Gruppen durchzuführen, wurden die gemessenen Extinktionswerte in der Verdünnungsstufe 1:30 herangezogen. Die einzelnen Gruppen wurden nach den Carrierproteinen KLH und ChTxB getrennt aufgeführt. Des Weiteren wurden die wasserlöslichen und die ölhaltigen Adjuvantien miteinander verglichen. Die oral immunisierten Tiergruppen wurden von den subkutan immunisierten Gruppen separat dargestellt. Die folgenden Säulendiagramme stellten einerseits die Höhe der gebildeten Serumantikörper der unterschiedlichen Gruppen dar, andererseits waren die Veränderungen in der Antikörperproduktion nach der ersten und zweiten Boosterung im Vergleich zur Immunisierung sichtbar (Abbildung 13a-e).

a) Tiergruppen mit dem Carrier KLH (Abbildung 13a):

Die erste Boosterung bewirkte nur bei den Gruppen 2, 4 und 5 eine Verstärkung der Antikörperproduktion, die bei Gruppe 2 am stärksten war. Nach der zweiten Boosterung konnte für Gruppe 4 und 5 eine Erhöhung der Extinktionswerte gemessen werden. Bei Gruppe 2 kam es jedoch zu einem sichtbaren Abfall der Antikörperbildung.

Für die Gruppe 6 führte erst die zweite Boosterung zur Produktion messbarer Antikörpermengen, die dann ebenfalls hohe Werte erreichten.

In Gruppe 1 konnte während des Versuchs keine messbare Antikörperproduktion nachgewiesen werden.

b) Tiergruppen mit dem Carrier ChTxB (Abbildung 13b):

Die erste Boosterung bewirkte nur bei Gruppe 8 eine deutliche Verstärkung der Antikörperproduktion. Die zweite Boosterinjektion führte zu einem Absinken der Extinktionswerte.

Für alle anderen Gruppen mit dem Carrier ChTxB konnte sowohl nach der ersten als auch nach der zweiten Boosterung keine messbare Produktion von spezifischen Antikörpern gegen rSyb270-76 nachgewiesen werden.

c) Oral immunisierte Tiergruppen (Abbildung 13c):

d) Tiergruppen, die mit wasserlöslichen Adjuvantien geimpft wurden (Abbildung 13d):

Für die Gruppen 4 und 5 konnte nach der ersten und nach der zweiten Boosterung eine deutliche Verstärkung in der Antikörperproduktion nachgewiesen werden.

Bei Gruppe 8 war nach der ersten Boosterung ein Anstieg in der Antikörperbildung festzustellen. Nach der zweiten Boosterung wurde ein Abfall der Serumantikörperproduktion beobachtet.

Für alle anderen Gruppen, die mit wasserlöslichen Adjuvantien geimpft wurden, konnte sowohl nach der ersten als auch nach der zweiten Boosterung keine messbare Antikörperproduktion festgestellt werden.

e) Tiergruppen, die mit ölhaltigen Adjuvantien geimpft wurden (Abbildung 13e):

Gruppe 2 zeigte nach der ersten Boosterung einen sehr starken Anstieg in der Antikörperbildung gegenüber der Immunisierung, der aber nach der zweiten Boosterung wieder abzusinken begann.

Für die Gruppe 6 führte erst die zweite Boosterung zur Produktion messbarer Antikörpermengen, die dann jedoch ebenfalls hohe Werte erreichten.

Im Folgenden wurden die Extinktionswerte aller immunisierten Gruppen in der Verdünnungsstufe 1:30 nach der Immunisierung, der ersten und zweiten Boosterung graphisch dargestellt.

Priming (Serum Tag 28) 1.Booster (Serum Tag 56)2. Booster (Serum Tag 84)

Kontrollgruppe KLH + P

KLH + Specol KLH + Im

munEasy™

KLH + AdjuP e™

KLH + Algen-LPS-Öadj.

BS rim

l 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1,600

rSyb2 (70-76) -AK (OD 450 nm)

)

Abbildung 13a: Tiergruppen mit dem Carrier KLH:

ELISA zur Bestimmung des Antikörpertiters gegen rSyb270-76 jeweils 28 Tage nach der ersten Immunisierung (Priming), der ersten und zweiten Boosterung in Abhängigkeit vom Adjuvans (Serenverdünnung 1:30, Coating-Antigen: rSyb270-76: 0,5 µg je well in 50 µl PBS). Die Kontrolle zum Tag 0 (alle Gruppen zeigen keine Antikörperbildung) ist nicht dargestellt.

Priming (Serum Tag 28)1.Booster (Serum Tag 56)2. Booster (Serum Tag 84)

trollgrupp hTxB + PB xB + Spe ImmunEa + AdjuPri lgen-LPS xB + Diluv xB + Im

je col S e

sy™ me™

-Öla ac fo

ct® Alum rte dj.

0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1,600

rSyb2 (70-76) -AK (OD 450 nm)

)

1.Booster (Serum Tag 28) 3.Booster (Serum Tag 56)5. Booster (Serum Tag 84)

Kontrollgruppe ChTxB + PBS (oral)

ChTxB + Im munEasy™ (oral) 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1,600

rSyb2 (70-76) -AK (OD 450 nm)

Abbildung 13c: Oral immunisierte Tiergruppen:

ELISA zur Bestimmung des Antikörpertiters gegen rSyb270-76 jeweils 14 Tage nach der ersten, dritten und fünften Boosterung (diese Tiergruppen wurden alle 14 Tage geboostert) in Abhängigkeit vom Adjuvans (Serenverdünnung 1:30, Coating-Antigen:

rSyb270-76: 0,5 µg je well in 50 µl PBS). Die Kontrolle zum Tag 0 (alle Gruppen zeigen keine Antikörperbildung) ist nicht dargestellt.

Priming (Serum Tag 28)1.Booster (Serum Tag 56)2. Booster (Serum Tag 84)

Kontrollgrupp KLH + Im

munEas KLH + AdjuPri ChTxB + Im

mun

™

ChTxB + Adju

™

ChTxB + Imje lum

ChTxB + Dil forte

y™ e me™

Easy Prime ct® A uvac 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1,600

rSyb2 (70-76) -AK (OD 450 nm)

)

Abbildung 13d: Wasserlösliche Adjuvantiengruppen:

Priming (Serum Tag 28)

1.Bo 56)

2. Booster (Serum Tag 84) oster (Serum Tag

Kontrollgrupp KLH + Spe Algen-LPS -ChTxB +

+ Algen-LP col e

Öladj Spec

S-Öladj. ol .

0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1,600

rSyb2 (70-76) -AK (OD 450 nm)

)

4.2.2 SDS-Gelelektrophorese und Western Blot zum Nachweis von Antikörpern

Im Dokument Verträglichkeit und Effektivität neuer synthetischer Adjuvantien bei der Erzeugung von Antikörpern gegen Synaptobrevin 2-Fragmente in der Balb/c-Maus (Seite 53-64)