4. Ergebnisse
4.6 Einfluss des Y402H-Polymorphismus auf die Cofaktor-
4.6.2 Einfluss des Y402H-Polymorphismus auf die FH-abhängige
Wie in 4.6.1 dargestellt, erfolgt die FH-abhängige Konversion von C3b in iC3b sehr schnell (in weniger als 5 min). Daher ist die Untersuchung möglicher funktioneller Unterschiede zwischen den beiden polymorphen FH-Formen bezüglich der iC3b-Generierung mittels kinetischer Analyse nicht praktikabel. Es wurde deshalb eine vergleichende Dosis-Wirkungskurve für die iC3b-Bildung angefertigt. In dem in Kap.
3.10.1 (S. 55) beschriebenen Versuch wurden 150 µg/ml C3b und 5 µg/ml FI für 2 min und bei 37°C mit gepooltem FH-402Y oder FH-402H inkubiert. Dabei wurden jeweils aufsteigende FH-Konzentrationen von 0-25 µg/ml eingesetzt. Die Reaktion wurde mit Mercaptoethanol-haltigem SDS-PAGE-Probenpuffer gestoppt. 2,25 µg C3b wurden auf je eine Bahn eines 10-%igen Laemmli-Gels aufgetragen. Die C3b-Fragmente wurden unter reduzierenden Bedingungen elektrophoretisch aufgetrennt, mittels Immunoblot mit den beiden monoklonalen Antikörpern I3/15 und B3/6 nachgewiesen und die Banden-Intensität anschließend densitometrisch gemessen.
Im oberen Teil der Abb. 4.20 wird der dosisabhängige Anstieg der Intensität des '68 -Fragments im Immunoblot vergleichend für beide FH-Varianten gezeigt. Im unteren Teil der Abbildung wird dieser Zusammenhang als prozentualer Anteil des in iC3b überführten C3b am Gesamt-C3b dargestellt. Unter Verwendung beider polymorpher FH-Varianten befand sich die iC3b-Generierung ab einer FH-Konzentration von 12,5 µg/ml in der Sättigung. FH-402Y und FH-402H zeigten keinen Unterschied in ihrer Cofaktor-Aktivität für die Spaltung von C3b in iC3b.
Ergebnisse 87
Abb. 4.20 Cofaktor-Aktivität von FH-402Y und FH-402H für die Generierung von iC3b.
C3b (150 µg/ml) wurde mit Faktor I (5 µg/ml) und entweder gepooltem 402Y oder FH-402H (0-25 µg/ml) bei 37°C für 2 min inkubiert. Die Reaktion wurde mit SDS-Probenpuffer und Mercaptoethanol gestoppt. Die C3b-Fragmente wurden in einem 10%igen Laemmli-Gel aufgetrennt und mittels Immunoblot mit den mAk I3/15 C3b/iC3b/C3dg) und B3/6 (anti-C3--Kette) nachgewiesen, gefolgt von Peroxidase-konjugiertem Kaninchen-anti-Maus-Ig als Sekundärantikörper. Die Banden-Intensität wurde densitometrisch gemessen. Die C3-Spaltprodukte sind als Prozent der Summe von ’, ’68 und C3dg angegeben. Zusätzlich wurden die Ergebnisse durch Bestimmung der Intensität der -Ketten-Bande korrigiert. Die Symbole stehen für die ermittelten Durchschnittswerte ± Standardabweichung aus 3 Experimenten.
4.6.3 Einfluss des Y402H-Polymorphismus auf die FH-abhängige C3dg-Generierung in der flüssigen Phase
Zur Untersuchung des möglichen Einflusses des Y402H-Polymorphismus auf die Prozessierung von iC3b zu C3dg wurde die C3dg-Bildung in Anwesenheit von FH-402Y oder FH-402H in Abhängigkeit von der FH-Konzentration und von der Zeit dokumentiert. Zum Erstellen der Dosis-Wirkungs-Kurve wurden 150 µg/ml C3b mit 5 µg/ml FI und aufsteigenden Konzentrationen (0-500 µg/ml) gepooltem FH-402Y oder FH-402H bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde nach 5 min mit Mercaptoethanol-haltigem SDS-PAGE-Probenpuffer abgestoppt. Zum Anfertigen der Kinetik wurden 150 µg/ml C3b mit 5 µg/ml FI und 50 µg/ml gepooltem FH-402Y oder FH-402H bei 37°C inkubiert und die Reaktion nach 1 min, 5 min, 7,5 min, 10 min, 20 min oder 30 min durch Zugabe von Mercaptoethanol-haltigem SDS-PAGE-Probenpuffer abgebrochen.
Pro Bahn wurden 2,25 µg C3b auf ein 10-%iges Laemmli-Gel aufgetragen. Nach elektrophoretischer Auftrennung unter reduzierenden Bedingungen wurden die C3b-Fragmente mittels Immunoblot mit den beiden monoklonalen Antikörpern I3/15 und
Ergebnisse 88
B3/6 und anschließend mit Peroxidase-konjugiertem Kaninchen-anti-Maus-Ig nachgewiesen. Die Intensität der Banden wurde densitometrisch bestimmt.
Die Ergebnisse sind Abbildung 4.21 zu entnehmen. Es ist jeweils oben die C3dg-Bildung im Immunoblot und darunter die dazugehörige densitometrische Auswertung zu sehen. In Abbildung 4.21 A ist die C3dg-Generierung in Abhängigkeit von der FH-Konzentration dargestellt. Es ist zu erkennen, dass in Anwesenheit von FH-402H weniger C3dg gebildet wurde als in Anwesenheit von FH-402Y. Dieser Unterschied ist im Bereich der physiologischen FH-Konzentration (125 µg/ml – 500µg/ml) am stärksten ausgeprägt. 500 µg/ml FH-402Y führten zu einer Überführung von 25,5 % des eingesetzten C3b in C3dg. Unter Verwendung von 500 µg/ml FH-402H wurden dagegen nur 7,7 % C3b in C3dg umgewandelt. Diese eingeschränkte Aktivität der polymorphen Variante FH-402H lässt sich auch anhand der in Abb. 4.21 B gezeigten kinetischen Analyse nachweisen. Nach 20 min befanden sich die C3dg-Spiegel in Anwesenheit von FH-402Y mit 19,9 ± 4,5 % umgewandeltem C3b in der Sättigung.
Nach derselben Zeit wurden mit FH-402H als Cofaktor nur 3,19 ± 0,6 % C3b in C3dg umgewandelt.
Der in Abb 4.22 abgebildete Immunoblot zeigt die FI-vermittelte Generierung von C3dg unter Verwendung von FH-Präparaten, die nicht gepoolt wurden, sondern von Einzelspendern stammten. Für den Versuch wurden zu 150 µg/ml C3b und 5 µg/ml FI 200 µg/ml FH-402Y oder FH-402H von Einzelspendern gegeben. Die Reaktion erfolgte für 5 min bei 37°C. Die C3-Fragmente wurden wie oben beschrieben mittels Immunblot nachgewiesen. Wie beim Vergleich der Intensität der Banden bei 37 kDa zu erkennen ist, wurde mit FH-402H (weiße Symbole) als Cofaktor deutlich weniger C3dg gebildet als mit FH-402Y (schwarze Symbole). Der bereits oben für die gepoolten Präparate beschriebene Befund ist also mit allen Einzelspender-Präparaten individuell reproduzierbar. Es stellte sich zusätzlich die Frage, ob die Unterschiede in der FH-abhängigen C3dg-Generierung allein auf den Polymorphismus an Position 402 zurückzuführen sind, oder möglicherweise auch durch den Aminosäureaustausch I62V hervorgerufen werden.
Der I62V-Genotyp der jeweiligen Spenders ist in Abb. 4.22 in Gestalt unterschiedlicher Symbole zusätzlich angegeben. Die FH-402Y-Präparate der Spender, die heterozygot oder homozygot für Isoleucin bzw. für Valin an Position 62 sind, waren alle gleichermaßen imstande, iC3b in C3dg zu überführen. Somit verursacht allein der Austausch von Tyrosin gegen Histidin an Position 402 des FH-Moleküls die herabgesetzte Cofaktor-Aktivität für die FI-vermittelte Prozessierung von iC3b in C3dg.
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Abb. 4.21 Cofaktor-Aktivität von FH-402Y und FH-402H für die Generierung von C3dg.
C3b (150 µg/ml) wurde mit Faktor I (5 µg/ml) und entweder gepooltem 402Y oder FH-402H (A, 0-500µg/ml; B, 50 µg/ml) bei 37°C für 5 min (A) oder für 0-30 min (B) inkubiert. Die Reaktion wurde mit SDS-Probenpuffer und Mercaptoethanol gestoppt. Die C3b-Fragmente wurden in einem 10%igen Laemmli-Gel aufgetrennt und mittels Immunoblot mit den mAk I3/15 (anti-C3b/iC3b/C3dg) und B3/6 (anti-C3- -Kette) nachgewiesen, gefolgt von Peroxidase-konjugiertem Kaninchen-anti-Maus-Ig als Sekundärantikörper. Die Banden-Intensität wurde densitometrisch gemessen. Die C3-Spaltprodukte sind als Prozent der Summe von ’, ’68 und C3dg angegeben. Zusätzlich wurden die Ergebnisse durch Bestimmung der Intensität der -Ketten-Bande korrigiert. Die Symbole stehen für die ermittelten Durchschnittswerte ± Standardabweichung aus 3 Experimenten.
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Abb. 4.22 Cofaktor-Aktivität (C3dg-Generierung) von FH-402Y und FH-402H von Einzelspendern. C3b (150 µg/ml) wurde mit Faktor I (5 µg/ml) und Faktor H (200 µg/ml) von Einzelspendern versetzt, die entweder homozygot für 402Y (schwarze Symbole) oder FH-402H (weiße Symbole) sind. Die Reaktion wurde nach 30 min mit SDS-Probenpuffer und Mercaptoethanol gestoppt. Die C3b-Fragmente wurden in einem 10%igen Laemmli-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und mittels Immunoblot mit den mAk I3/15 (anti-C3b/iC3b/C3dg) und B3/6 (anti-C3- -Kette) nachgewiesen, gefolgt von Peroxidase-konjugiertem Kaninchen- anti-Maus-Ig als Sekundärantikörper. Der I62V-Genotyp ist folgendermaßen dargestellt: , Ile/Ile; , Ile/Val; /, Val/Val.