Einfluss des Y402H-Polymorphismus auf die C3dg-

FH-Konzentrationen unter 250 µg/ml im Serum zu keiner nennenswerten C3dg-Generierung. Die FH-vermittelte Bildung von C3dg in Serum benötigt also die Anwesenheit von FH in hochphysiologischen Konzentrationen.

Abb. 4.24 Einfluss der FH-Konzentration auf die C3dg-Generierung in Serum. FH-402Y (0-500 µg/ml) wurde zu FH-Serum gegeben. Das Serum wurde mit je 10 mM Ca²⁺ und Mg²⁺ sowie 10 mg/ml Zymosan versetzt und für 2 h bei 37°C inkubiert. 1 µl Serum wurde mit SDS-Probenpuffer vermengt. Die C3-Fragmente im Serum wurden anschließend in einem 10%igen Laemmli-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und mittels Immunoblot mit den mAk I3/15 (anti-C3b/iC3b/C3dg) und B3/6 (anti-C3--Kette) nachgewiesen, gefolgt von Peroxidase-konjugiertem Kaninchen-anti-Maus-Ig als Sekundärantikörper.

4.7.2 Einfluss des Y402H-Polymorphismus auf die C3dg-Generierung in Serum

Zu FH-Serum wurden entweder 250 µg/ml gepoolter FH-402Y oder FH-402H gegeben. CaCl₂ und MgCl₂ wurden resubstituiert und durch Zugabe von 10 mg/ml Zymosan das Komplementsystem im Serum aktiviert. Das Serum wurde bei 37°C inkubiert und die Reaktion nach 1 h, 2 h und 4 h mit 0,1 M EDTA abgestoppt. 1 µl Serum wurde mit SDS-Probenpuffer vermengt, gekocht und in eine Tasche eines 10%igen Laemmli-Gels gegeben. Die anschließende Elektrophorese erfolgte unter nicht reduzierenden Bedingungen. C3dg wurde im Immunoblot mit dem mAk I3/15 nachgewiesen. Die Intensität der C3dg-Bande im Blot wurde densitometrisch gemessen. Der Immunoblot ist in Abbildung 4.25 mit der zugehörigen densitometrischen Auswertung dargestellt. In Anwesenheit von FH-402H wurde

Ergebnisse 93

signifikant weniger C3dg im Serum gebildet als in Anwesenheit von FH-402Y. So betrug der nach 4 h mit FH-402H ermittelte Wert für C3dg nur 36,5 ± 14,2 % des für FH-402Y ermittelten Wertes. Der in 4.6.3 beschriebene Befund konnte somit in Serum reproduziert werden.

Abb. 4.25 Generierung von C3dg in Serum in Anwesenheit von FH-402Y oder FH-402H.

Gepoolter FH-402Y oder FH-402H (200 µg/ml) wurden zu FH-Serum gegeben. Das Serum wurde mit je 10 mM Ca²⁺ und Mg²⁺ sowie 10 mg/ml Zymosan versetzt und bei 37°C inkubiert.

Die Reaktion wurde zu verschiedenen Zeitpunkten mit EDTA gestoppt. 1 µl Serum wurde mit SDS-Probenpuffer vermengt. Die C3-Fragmente im Serum wurden anschließend in einem 10%igen Laemmli-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und mittels Immunoblot mit den mAk I3/15 (anti-C3b/iC3b/C3dg) und B3/6 (anti-C3--Kette) nachgewiesen, gefolgt von Peroxidase-konjugiertem Kaninchen-anti-Maus-Ig als Sekundärantikörper. Die Intensität der C3dg-Bande wurde densitometrisch bestimmt. Die ermittelten Intensitäten wurden auf den 4 h-Wert bei Verwendung von FH-402Y normalisiert. Die Symbole im unteren Teil der Abbildung stehen für die Durchschnittswerte ± Standardabweichung aus 3 Experimenten.

Ergebnisse 94

4.7.3 Einfluss des Y402H-Polymorphismus auf die C3dg-Generierung in unmodifizierten Seren von Einzelspendern

In einem weiteren Experiment wurden unmodifizierte Seren von einzelnen Spendern benutzt, die homozygot für eine der polymorphen FH-Varianten sind. Die Komplementkaskade wurde durch Zugabe von 10 mg Zymosan/ml in Gang gesetzt. Die Aktivierung erfolgte über 2 Stunden bei 37°C, wonach die Reaktion mit 0,1 M EDTA abgestoppt wurde. 1 µl Serum wurde mit SDS-Probenpuffer vermengt, gekocht und in eine Tasche eines 10%igen Laemmli-Gels appliziert. Die C3b-Fragmente wurden elektrophoretisch unter nicht reduzierenden Bedingungen aufgetrennt. Das C3dg-Fragment wurde mittels Immunoblot mit dem mAk I3/15 nachgewiesen und die Intensität der Bande densitometrisch gemessen. Anhand eines ebenfalls auf das Gel aufgetragenen C3dg-Standards wurde die C3dg-Konzentration im jeweiligen Serum ermittelt. Parallel dazu wurden die Konzentrationen von FH, C3, iC3b, und weiteren Komplementaktivierungsprodukten in denselben Seren mittels ELISA gemessen. Alle ermittelten Daten sind in Abbildung 4.26 zusammengefasst. Der Abbildung ist zu entnehmen, dass in den Seren derjenigen Spender, die homozygot für die Histidin- Variante sind, im Durchschnitt signifikant weniger C3dg nach Aktivierung gemessen wurde als in den Seren der für Tyrosin homozygoten Spender. Im Einklang damit stehen die in den aktivierten Seren gemessenen iC3b-Konzentrationen. Diese sind

Abb. 4.26 C3-Prozessierung in unmodifizierten Seren von Einzelspendern. Seren von Einzelspendern, die entweder homozygot für FH-402Y (n=7) oder FH-402H (n=8) sind, wurden mit 10 mg/ml Zymosan versetzt und für 2 h bei 37°C inkubiert. Zur Bestimmung der C3dg-Konzentration wurden 1 µl aktiviertes Serum von jedem Spender, sowie ein C3d-Standard auf ein 10%iges Laemmli-Gel aufgetragen. Die C3-Fragmente wurden elektrophoretisch aufgetrennt und C3dg im Immunoblot mit dem mAk I3/15 nachgewiesen. Die Intensität der Banden wurde densitometrisch gemessen und anhand des C3d-Standards auf µg/ml umgerechnet. iC3b in den Zymosan-aktivierten Seren, sowie C3 und FH im Ausgangsmaterial wurden mittels ELISA gemessen. Schwarze Balken: nicht aktiviertes Serum; schraffierte Balken: Serum nach Aktivierung mit Zymosan

Ergebnisse 95

entsprechend niedriger in den Seren der FH-402Y-Spender als in denen der FH-402H-Spender. Beide Befunde sprechen für eine reduzierte Aktivität von FH-402H als Cofaktor für die Prozession von iC3b zu C3dg. Es ist allerdings zu beachten, dass in den Seren der FH-402H-Spender um ca. 20% geringere Ausgangskonzentrationen C3 gemessen wurden. Die FH-Konzentrationen sind im Durchschnitt in beiden Spendergruppen annähernd gleich. Aus diesen Untersuchungen kann zusammenfassend geschlossen werden, dass neben der FH-Konzentration der Y402H-Genotyp die Effektivität der Umwandlung von iC3b in C3dg in Serum entscheidend bestimmt.

4.8 Einfluss des Y402H-Polymorphismus auf die Cofaktor-Aktivität auf Zelloberflächen

Die Cofaktor-Aktivität von FH-402Y und FH402H auf Zelloberflächen wurde an RBL-Zellen untersucht. Diese RBL-Zellen tragen keine membranständigen Regulatoren, die mit dem humanen Komplementsystem interagieren und lassen sich daher durch Inkubation in humanem Serum mit C3b beladen. Die Prozessierung des membrangebundenen C3b wurde mittels FACS quantifiziert. Dabei wurden zwei verschiedene mAk in der FACS-Färbung eingesetzt. Der mAk B3/6 bindet die C3-ß-Kette. Mit ihm konnte die Umwandlung von iC3b in C3dg durch Verlust des -Ketten-Signals registriert werden.

Der gegen C3b/iC3b/C3dg gerichtete mAk I3/15 bindet an die -Kette und diente als Kontrollantikörper (Abb.4.27).

Abb. 4.27 Nachweisprinzip von C3dg auf RBL-Zellen. C3b ist über die -Kette kovalent an Aminosäurereste (®) von Oberflächenproteinen der RBL-Zelle gebunden. Nach Inkubation der Zellen mit FH und Faktor I entstehen die finalen C3-Fragmente C3dg und C3c, welches in den Überstand freigelassen wird. C3dg bleibt an der Zelloberfläche gebunden. Die C3-Fragmente wurden mit dem mAk I3/15, der ein konvertiertes Epitop auf C3b, iC3b und C3dg erkennt, und dem anti--Ketten-mAk B3/6 nachgewiesen. Die Überführung von C3b/iC3b in C3dg ist somit durch die Abnahme des B3/6-Signals auf den RBL-Zellen mittels FACS festzustellen.

Ergebnisse 96