4 Ergebnisse
4.10 Einfluss von Regorafenib auf Makrophagen und das Tumormikromilieu in vitro und in
Der Einfluss des Tumormikromilieus stellt einen weiteren Mechanismus dar, der zu einem gesteigerten Tumorwachstum und einer erhöhten Invasivität von Tumoren führen kann. Auch aufgrund der gezeig-ten Dagezeig-ten kann nicht ausgeschlossen werden, dass Regorafenib Effekte auf Zellen des Tumormikromili-eus ausübt, welche wiederum die Resistenz durch parakrine Effekte auf die Tumorzellen vermitteln. Da auch in pankreatisch neuroendokrinen Tumoren die Infiltration von Makrophagen mit einer schlechten Prognose des Patienten verbunden ist, stellen Tumor-assoziierte Makrophagen einen wichtigen Zelltyp des Tumormikromilieus in dieser Tumorentität dar. Der CSF1R-Rezeptor von Makrophagen ist bereits als eine Zielstruktur von Regorafenib beschrieben. In den folgenden Experimenten sollte daher der Ef-fekt von Regorafenib auf Makrophagen in vitro und in vivo untersucht werden.
4.10.1 Einfluss von Regorafenib auf die Viabilität von primären murinen Makrophagen in vitro
Im ersten Schritt sollte der Effekt von Regorafenib auf die Viabilität in primären murinen Makrophagen untersucht werden. Dazu wurden Monozyten aus dem Knochenmark von WT/BL6-Mäusen isoliert, mit mMCSF für 7 Tage zu Makrophagen differenziert und anschließend für 24 und 48 Stunden mit 0,1µM und 0,5µM Regorafenib behandelt. Die gewählten Regorafenib-Konzentrationen wurden, vergleichbar zu den PNET-Zelllinien, anhand des ermittelten IC50-Werts ausgewählt. Im ATP-basierten Viabilitäts-As-say zeigte sich ein zeit- und dosisabhängiger Effekt von Regorafenib auf die Makrophagen (Abbildung 61).
Abbildung 61: Regorafenib senkt die Viabilität von Makrophagen zeit- und dosisabhängig. Dargestellt ist die ge-messene Lumineszenz nach einer Behandlung mit 0,1% DMSO, 0,1µM und 0,5µM Regorafenib für 24 und 48 Stun-den relativ zur DMSO-Kontrolle. Angabe des Mittelwerts und der Standardabweichung (±SD) von drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten (ns nicht signifikant).
DMSO 0,1µM 0,5µM DMSO 0,1µM 0,5µM 0.0
0.5 1.0 1.5
ns
24h
Viabilität rel. zu DMSO
DMSO 0,1µM 0,5µM DMSO 0,1µM 0,5µM 0.0
0.5 1.0 1.5
ns
48h
Viabilität rel. zu DMSO
Da sich in dem Tumormikromilieu neben M0-Makrophagen ebenfalls Tumor-fördernde M2-polarisierte Makrophagen und pro-inflammatorische M1-Makrophagen befinden, sollte außerdem der Effekt auf diese drei Subpopulationen untersucht werden. Dazu wurden die primären Makrophagen zunächst mit LPS+IFNγ und. IL-4 in M1- bzw. M2-Makrophagen polarisiert und anschließend mit 0,5µM Regorafenib für weitere 24 und 48 Stunden behandelt. Die Polarisation wurde mittels qRT-PCR anhand von jeweils zwei charakteristischen M1- und M2-Markern bestätigt (siehe Anhang Abbildung 80). Die Auswertung des Viabilitäts-Assays zeigte zum einen, dass polarisierte Makrophagen eine deutlich höhere Viabilität haben, als die unpolarisierten M0-Makrophagen. Außerdem wurde deutlich, dass der beschriebene in-hibierende Effekt von Regorafenib auf M0-Makrophagen in den polarisierten M1 – und M2-Makropha-gen fast aufgehoben war (Abbildung 62). Somit scheint Regorafenib in dieser gewählten Konzentration insbesondere die M0-Makrophagen, weniger jedoch die polarisierten Makrophagen zu inhibieren.
Abbildung 62: Effekt von Regorafenib auf die Viabilität von polarisierten Makrophagen. Darstellung der gemesse-nen Lumineszenz nach einer Behandlung mit 0,5µM Regorafenib für 24 und 48 Stunden relativ zur DMSO-Kon-trolle. Angabe des Mittelwerts und der Standardabweichung (±SD) von 5 unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten (ns nicht signifikant).
DMSO
Viabilität rel. zu DMSO
DMSO
Viabilität rel. zu DMSO
24h 48h
4.10.2 Einfluss von Regorafenib auf die Viabilität in primären Makrophagen in vitro
Um zu untersuchen, ob Regorafenib in den primären Makrophagen zur Induktion von Apoptose führt und ob diese in den drei Subpopulationen unterschiedlich stark ausfällt, wurden Annexin V / Propidium (PI)-Iodid-Färbungen durchgeführt und durchflusszytometrisch gemessen. Dabei stellen die PI-/Annexin V+-Zellen die früh-apoptotischen Zellen und die PI+/Annexin V+-Zellen die spät-apoptotischen und nek-rotischen Zellen dar. In dieser Auswertung konnte gezeigt werden, dass Regorafenib in keinen der drei Subpopulationen (M0, M1 und M2) zu einer gesteigerten Apoptose im Vergleich zur DMSO-Kontrolle führte. Neben der erhöhten Viabilität, gemessen im ATP-Assay (Abbildung 62), lag der prozentuale An-teil der apoptotischen Zellen der M1- und M2-Makrophagen niedriger als in den unpolarisierten M0-Makrophagen (Abbildung 63A). Western Blot-Experimente konnten dieses Ergebnis durch das Fehlen eines gespalteten PARP1 unterstützen (Abbildung 63B).
Abbildung 63: Effekt von Regorafenib auf die Apoptose-Induktion in M0-, M1- und M2-Makrophagen. Die pri-mären Makrophagen aus nicht transgenen Mäusen wurden wie zuvor beschrieben für 4h durch die Zugabe von LPS+IFNy bzw. IL-4 zu M1 – und M2-Makrophagen polarisiert oder unbehandelt gelassen (M0). (A) Nach einer weiteren 24-stündigen Behandlung mit 0,5µM Regorafenib wurden der prozentuale Anteil von Propidium-Iodid (PI) und Annexin V (AV) durchlusszytometrisch bestimmt und früh-apoptotische Zellen (PI-/Annexin V+) von nekro-tischen Zellen (PI+/Annexin V+) unterschieden. (B) Die Proteinlysate wurden in Western Blot-Experimenten hin-sichtlich des Apoptose-Markers PARP1 untersucht (fl=full length, cl=cleaved).
B
M1+ Regorafenib
M0 + Regorafenib
M0 M1 M2 + Regorafenib
M2
4.10.3 Der CSF1-Rezeptor als eine mögliche Zielstruktur von Regorafenib in Makrophagen
Im nächsten Schritt sollte der Frage nachgegangen werden, welche Mechanismen zur gesenkten Viabi-lität der Makrophagen führen. Da der CSF1-Rezeptor bereits in der Literatur als eine beschriebene Ziel-struktur von Regorafenib aufgeführt wird und eine wichtige Rolle in der Differenzierung und dem Über-leben von Makrophagen spielt, stellte dieser Makrophagen-spezifische Rezeptor einen interessanten Angriffspunkt dar.
Um dieser Hypothese nachzugehen, wurden zuerst primäre M0-Makrophagen für 24h und 48h mit Re-gorafenib behandelt und die CSF1R-Expression mittels Western Blot analysiert. Anhand dieser Ergeb-nisse konnte eine deutliche Reduktion des CSF1-Rezeptors in den primären M0-Makrophagen unter Regorafenib zeit- und dosisabhängig gezeigt werden (Abbildung 64A). In weiteren Western Blot-Analy-sen mit Regorafenib behandelten M0-, M1- und M2-Makrophagen konnte die Reduktion des CSF1-Re-zeptors in den M0-Makrophagen bestätigt werden. Allerdings haben die Ergebnisse auch gezeigt, dass M1-Makrophagen eine nur sehr geringe CSF1R-Expression aufwiesen und diese durch Regorafenib nicht weiter inhibiert werden konnte. Die M2-Makrophagen wiesen im Vergleich zu den M0-Makrophagen eine etwas höhere CSF1R-Expression auf, die jedoch durch Regorafenib ebenfalls nicht beeinflusst wurde (Abbildung 64B). Ergänzend zu diesen Ergebnissen konnte eine Aktivität des CSF1R in M0-, M1- und M2 Makrophagen nachgewiesen werden, welche in den M1-Makrophagen erneut am geringsten ausfiel. Allerdings führte hierbei die Regorafenib-Behandlung in allen drei Makrophagen-Subtypen zu einer deutlich gesenkten CSF1R-Aktivität und einer damit verbundenen reduzierten Signaltransduktion.
Abbildung 64: Effekt von Regorafenib auf das CSF1R-Expressionslevel in murinen primären Makrophagen. Die un-polarisierten M0-makrophagen wurden wie vorher beschrieben in einer 6-Well-Platte ausgesät und für 24h und 48h mit 0,1% DMSO, 0,1 und 0,5 µM Regorafenib (A) oder zunächst in M1- und M2-Makrophagen polarisiert und für 24h mit 0,5µM Regorafenib behandelt (B). Die Proteinlysate wurden in Western Blot-Experimenten auf das Expressionslevel des CSF1R und pCSF1R (Tyr723) untersucht. Die Western Blot-Analyse stellt repräsentativ eines von drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten.
0,1 µM 0,5 µM