Effekte der Kombinationstherapie von Regorafenib und dem Bcl-2-Inhibitor ABT-199

Durch das vermehrte Auftreten einer erhöhten Bcl-2-Expression in der Behandlung von Tumoren wur-den in wur-den letzten Jahrzehnten diverse Bcl-2-Inhibitoren entwickelt. Einige davon finwur-den bereits Anwen-dung in der Klinik: Eine selektive pharmakologische Inhibition mit sog. „BH3-Mimetika“ stellt bei der Therapie der Chronisch-lymphatischen Leukämie (CLL) bereits einen neuen vielversprechenden Ansatz dar. Um zu überprüfen, ob eine simultane Hemmung des hochregulierten Bcl-2 im Tumor in vivo die Resistenz gegenüber Regorafenib aufhebt, wurden Kombinationstherapien mit Regorafenib und dem Bcl-2-Inhibitor ABT-199 (Venetoclax) in vitro durchgeführt.

Nach einer 48-stündigen Behandlung von BON-1-Zellen mit 6µM Regorafenib und 4µM ABT-199 wurden zunächst lichtmikroskopische Aufnahmen erstellt, anhand dessen eine Reduktion der Zellzahl und ein vermehrtes Auftreten von apoptotischen Zellen in der Kombinationstherapie im Vergleich zur Regorafe-nib-Monotherapie zu erkennen war (Abbildung 56).

Abbildung 56: Effekt von Regorafenib auf die Proliferation der BON-1-Zellen. Die BON-1-Zellen wurden wie vorher beschrieben in einer 6-Well-Platte ausgesät und mit 0,1% DMSO, 6µM Regorafenib, 4µM ABT-199 alleine oder in Kombination behandelt. Nach einer Inkubation von 48h wurden repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen (20x Vergrößerung) erstellt.

DMSO Regorafenib

ABT-199 ABT-199 + Regorafenib

Darauf aufbauend wurden Viabilitäts- Analysen durchgeführt. In den BON-1-Zellen ergab sich dabei ein synergistischer Effekt von Regorafenib und ABT-199 im Vergleich zur Einzelgabe (Abbildung 57A). In Western Blot-Analysen konnte eine deutliche Apoptose-Induktion in der Kombinationstherapie anhand von gespaltenem PARP1 nachgewiesen werden (Abbildung 57B). Des Weiteren fiel eine stark erhöhte Expression von MCL-1 unter der ABT-199-Monotherapie auf.

Abbildung 57: Synergistischer Effekt von Regorafenib und ABT-199 in BON-1-Zellen. Die Zellen wurden wie vorher beschrieben in einer 6-Well-Platte ausgesät und mit 0,1% DMSO, 6µM Regorafenib, 4µM ABT-199 alleine oder in Kombination bzw. der äquivalenten Menge DMSO für 48h behandelt. (A) Die Ergebnisse des ATP-basierten Assays stellen die gemessene Viabilität relativ zur DMSO-Kontrolle mit dem errechneten Mittelwert und der Standardab-weichung (±SD) aus drei unabhängigen Experimenten dar (*p≤0,05; ***p<0,001). (B) In den Western Blot-Analy-sen wurden die Proteinlysate hinsichtlich der Expression der anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinfamilie und des Apoptosemarkers PARP1 untersucht (fl=full length, cl=cleaved). β-Aktin diente als Ladekontrolle.Die Abbildungen stehen repräsentativ für drei unabhängig voneinander durchgeführte Experimente.

Analog zur Behandlung von BON-1-Zellen wurden ebenfalls QGP-1-Zellen mit Regorafenib und ABT-199 alleine und in Kombination behandelt. Anhand der lichtmikroskopischen Aufnahmen waren unter der Kombinationsbehandlung im Vergleich zur Einzeldosis eine geringere Zellzahl und vermehrt apoptoti-sche Zellen zu erkennen (Abbildung 58).

DMSO Regorafenib ABT-199 ABT-199 + Regorafenib

PARP1

Viabilität rel. zu DMSO

Abbildung 58: Effekt von Regorafenib auf die Proliferation der QGP-1-Zellen. Die QGP-1-Zellen wurden wie vorher beschrieben in der 6-Well-Platte ausgesät und mit 0,1% DMSO, 6µM Regorafenib, 4µM ABT-199 alleine oder in Kombination behandelt. Nach einer Inkubation von 48h wurden repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen (20x Vergrößerung) erstellt.

In den QGP-1-Zellen konnten nach der 48-stündigen Behandlung mit 6µM Regorafenib und 4µM ABT-199 vergleichbare Ergebnisse zu den BON-1-Zellen erzielt werden. Auch hier zeigte sich im Viabilitäts-Assay ein synergistischer Effekt von der Kombinationstherapie im Vergleich zur Einzelgabe (Abbildung 59A). Die Induktion der Apoptose konnte anschließend ebenfalls in Western Blot-Analysen anhand des Nachweises des PARP1-Spaltprodukts nachgewiesen werden. Die Hochregulation von Mcl-1 unter ABT-199-Monotherapie war auch in den QGP-1-Zellen zu erkennen, wenngleich sie nicht so stark ausgeprägt war, wie in den BON-1-Zellen (Abbildung 59B).

DMSO Regorafenib

ABT-199 ABT-199 + Regorafenib

Abbildung 59: Synergistischer Effekt von Regorafenib und ABT-199 in QGP-1-Zellen. Die Zellen wurden wie vorher beschrieben ausgesät und mit 6µM Regorafenib, 4µM ABT-199 alleine oder in Kombination bzw. der äquivalenten Menge DMSO für 48h behandelt. (A) Die Ergebnisse des ATP-basierten Assays stellen die gemessene Viabilität relativ zur DMSO-Kontrolle mit dem errechneten Mittelwert und der Standardabweichung (±SD) aus drei unab-hängigen Experimenten dar (*p≤0,05; ***p<0,001). (B) In den Western Blot-Analysen wurden die Proteinlysate hinsichtlich der Expression der anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinfamilie und des Apoptosemarkers PARP1 unter-sucht (fl=full length, cl=cleaved). β-Aktin diente als Ladekontrolle.Die Abbildungen stehen repräsentativ für drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimente.

DMSO Regorafenib ABT-199 ABT + Regorafenib

PARP

Cyclin D3

Mcl-1 PCNA

Bcl-xL Bcl-2 ß-Aktin

A B

fl cl

DMSO Regoraf

enib

ABT-199

ABT-199 + Regora fenib 0.0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

***

***

*

***

Viabilität rel. zu DMSO

Neben dem Effekt in den humanen PNET-Zelllinien konnte die Kombinationstherapie von Regorafenib und ABT-199 auch in den murinen β-Tumorzellen eine gesenkte Viabilität und Apoptose induzieren. In Western Blot-Analysen konnte dies wiederholt an dem gespalteten PARP1 gezeigt werden. Die Hochre-gulation von Mcl-1 unter der ABT-199-Monotherapie war in diesen Zellen nicht so stark ausgeprägt (Ab-bildung 60).

Abbildung 60: Synergistischer Effekt von Regorafenib und ABT-199 in den murinen β-Tumorzellen. Die Zellen wur-den wie vorher beschrieben in einer 6-Well-Platte ausgesät und mit 0,1% DMSO, 10µM Regorafenib, 4µM ABT-199 alleine oder in Kombination für 48h behandelt. In den Western Blot-Analysen wurden die Proteinlysate hin-sichtlich der Expression der anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinfamilie und des Apoptosemarkers PARP1 untersucht (fl=full length, cl=cleaved). β-Aktin diente als Ladekontrolle. Die Abbildungen stehen repräsentativ für drei unab-hängig voneinander durchgeführte Experimente.

Die in vitro Daten deuten darauf hin, dass die alleinige Gabe von Regorafenib durch die Überexpression von Bcl-2 zu einem gesteigerten Überleben führt, welches durch die Apoptose-Induktion in der Kombi-nationstherapie aufgehoben werden konnte. Die Kombination des Multityrosinkinase-Inhibitors Rego-rafenib und des Bcl-2-Inhibitors stellt daher einen möglichen vielversprechenden Ansatz in der Behand-lung von PNETs in vitro und auch in vivo dar. Weiterführende Experimente im RIP1Tag2-Mausmodell wurden im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht durchgeführt.

PARP1 PCNA

DMSO ABT-199 + Regorafenib

Regorafenib ABT-199

HMEG-1 HMEG-2 HMEG-3

ß-Aktin Bcl-2 Bcl-XL

Mcl-1

DMSO ABT-199 + Regorafenib

Regorafenib ABT-199 DMSO ABT-199 + Regorafenib

Regorafenib ABT-199 fl

cl

4.10 Einfluss von Regorafenib auf Makrophagen und das