Eine neue Synthese für die Darstellung von cycloAmb-PMEA-Prodrugs

Da aufgrund der niedrigen Ausbeuten nicht genügend Substanzmengen für die Durch-führung antiviraler Tests zur Verfügung standen, war eine erste Schlüsselaufgabe in dieser Arbeit die Entwicklung einer neuen Synthese für cycloAmb-PMEA-Prodrugs. Die vor den cycloAmb-PMEA-Verbindungen dargestellten cycloSal-PMEA-Derivate wurden prinzipiell auf die gleiche Weise synthetisiert, allerdings war hier die Adenin-NH2-Gruppe MMTr(Monomethoxytrityl)-geschützt, was noch einen Entschützungsschritt erforderlich machte. Die Gesamtausbeuten waren dadurch mit 21 - 39 % deutlich höher, aber die Reaktionsdurchführung war natürlich genauso aufwendig wie bei der Synthese der cycloAmb-PMEA-Prodrugs. Außerdem konnte beobachtet werden, dass Teilent-schützung bei der Chlorierung mit PCl5 auftrat.

Die bisher gemachten Erfahrungen legten also eine neue Synthesemethode für PMEA-Prodrugs nahe. Es ist bekannt, dass die Synthese von Phosphonat-PMEA-Prodrugs meist problematisch ist und häufig nur geringe Ausbeuten liefert. Die Synthese von Phosphonamidat 13 ergibt eine Ausbeute von 5 %. bis(POM)PMEA 14 kann immerhin in einer Ausbeute von 32 % dargestellt werden.⁵⁴ Die beste Ausbeute von 53 % wird bei der Synthese von bis(SATE)PMEA 12 erzielt.⁵⁵ Diese Synthesemethode für SATE-Prodrugs wurde schon bei der Darstellung von cycloSal-PMPA- und PMEA-SATE-Prodrugs verwendet. Hier wurden Ausbeuten von 23 - 41 % erzielt. Das ist ein gutes Ergebnis, aber ein gravierender Nachteil dieser Synthese besteht darin, dass zur Reaktion der Maske mit der Phosphonsäure der sehr teure Aktivator 1-Mesitylen-2-sulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazol eingesetzt wird, was die Anwendbarkeit stark einschränkt. Wenn viele Prodrugs synthetisiert werden müssen oder in großem Maßstab gearbeitet wird, würden erhebliche Kosten entstehen. Deshalb sollte auf diese kostspielige Synthesemethode verzichtet werden. Eine sehr interessante Synthese wurde bei der Darstellung von HepDirect Prodrugs angewendet.⁵⁶ Hier wurde PMEA 9 in einer Ausbeute von 40 % mit einem bidenten Nucleophil in einer Eintopfreaktion zum PMEA-Diester 51 umgesetzt (Abb. 30).

N N N

N

NH₂

O P

51 O O

O Cl

Abb. 30 PMEA-HepDirect Prodrug 51

Es handelt sich dabei um eine sehr elegante Synthese, da die Adenin-NH2-Gruppe während der Synthese ohne größeren Aufwand geschützt wird und die Schutzgruppe am Ende leicht abgespalten werden kann. Die Synthese selbst und ihre Anwendung zur Darstellung von cycloAmb-PMEA-Prodrugs 31 werden im Folgenden detailliert be-schrieben.

Im ersten Schritt der Synthese wird PMEA 9 in sein Phosphonsäurechlorid überführt und gleichzeitig die Adenin-NH2-Gruppe geschützt. Dazu wird 1 Äquivalent PMEA 9 in Dichlormethan suspendiert und 1.1 Äquivalente N,N-Diethylformamid (DEF) zugegeben.

Die Reaktion wird durch die Zugabe von 3.5 Äquivalenten Oxalylchlorid und anschließendes Refluxieren gestartet. Das Oxalylchlorid bildet zunächst mit dem DEF ein Vilsmeierreagenz. Dieses Vilsmeierreagenz kann eine Phosphonsäure chlorieren, dafür würden aber katalytische Mengen an Oxalylchlorid genügen. Entscheidend ist, dass das Vilsmeierreagenz durch die NH2-Gruppe nucleophil angegriffen werden kann und diese so geschützt wird. Im Reaktionsverlauf konnten Chlorierung und Schützung von PMEA 9 zum geschützten Phosphonsäurechlorid 50a beobachtet werden, weil das Entstehen einer klaren Lösung auftrat. Durch seine deutlich höhere Lipophilie gegenüber PMEA 9 ist Zwischenprodukt 50a (Abb. 31, nächste S.) in Dichlormethan sehr gut löslich. Die Färbungen dieser Lösungen reichten von hellgelb über grün bis dunkelbläulich. Die Färbung der Reaktionslösung hatte aber keine Aussagekraft über das Gelingen dieses ersten Reaktionsschrittes. Entscheidender war das Auftreten entsprechend der Reaktionslösung gefärbter Schäume nach Entfernen des Dichlormethans und überschüssigen Oxalychlorids im Vakuum. Wurden Öle beobachtet, konnten später keine Prodrugs isoliert werden, weshalb dies als deutlicher Hinweis für ein Scheitern der Reaktion im ersten Schritt gewertet wurde.

N N N

N

NH₂

O 9 P O HOHO

(COCl)₂, DEF, DCM, Reflux

N N N

N N

O P O ClCl

N

50a Abb. 31 Syntheseschritt 1: Chlorierung und Schützung

Für den zweiten Reaktionsschritt wurde das Zwischenprodukt 50a erneut in Dichlor-methan aufgenommen. Diese Lösung wurde auf 0 °C gekühlt und 2 Äquivalente Pyridin als Aktivator zugegeben. Die Aktivierung durch Pyridin wurde in der Synthese von HepDirect Prodrug 51 und bei den meisten Darstellungen von cycloAmb-Nucleosid-phosphonat-Prodrugs angewendet. Allerdings konnte bei späteren Experimenten gezeigt werden, dass der Verzicht auf die Aktivierung durch Pyridin keine schlechteren Ausbeuten zur Folge hatte. In allen Fällen blieb aber der nächste Schritt gleich, nämlich die Durchführung der Kupplung. Es wurde eine separate Lösung aus den entsprechenden 2-Aminobenzylalkoholen 52 (1 Äquivalent), Diisopropylethylamin (DIPEA) oder Triethylamin (6.3 Äquivalente) und Dichlormethan angesetzt und auf -80

°C gekühlt (Abb. 32). In dieses Gemisch wurde die Lösung von Zwischenprodukt 50a getropft.

N N N

N N

O P O ClCl

N

50a

1.) Pyridin

2.) 2-Aminobenzylalkohol 52a, DIPEA oder

TEA, DCM,-80 °C N

N N N

N

O P O

N

53 NH

O

Abb. 32 Syntheseschritt 2: Kupplung

Nach Erwärmen der Reaktionslösung über Nacht auf Raumtemperatur wurden die flüchtigen Bestandteile im Vakuum entfernt. Danach erfolgte die Entschützung der Adenin-NH2-Gruppe im dritten Reaktionsschritt. Das Rohprodukt wurde in Ethanol/

Essigsäure (19:1) aufgenommen und refluxiert (Abb. 33).

N N N

N N

O P O

N

53 NH

O

N N N

N

NH₂

O P O

31a NH

O EtOH, HOAc,

Reflux 33 %

Abb. 33 Syntheseschritt 3: Entschützung

Das Ende der Reaktion wurde durch DC-Kontrolle festgestellt. Danach wurden die flüchtigen Bestandteile erneut im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde danach zunächst zur Vorreinigung an Kieselgel chromatographiert. Danach wurden die Zielver-bindungen am Chromatotron gereinigt. Häufig war hier mehrmaliges Chromato-graphieren nötig, um die Prodrugs in erwünschter Reinheit zu isolieren. Entscheidend war, dass mindestens eine Trennung am Chromatotron mit Ethylacetat/ Methanol durchgeführt wurde, da mit dem Laufmittel Dichlormethan/Methanol die DIPEA- bzw.

Triethylammoniumsalze nicht abgetrennt werden konnten. Die Abtrennung UV-aktiver und farbiger Verunreinigungen war unproblematischer und konnte in Dichlor-methan/Methanol bequem durchgeführt werden.

Mit der neuen Synthese wurde cycloAmb-PMEA 31a in einer Ausbeute von 33 % dargestellt, was mit der bis dahin durchgeführten Synthese nur in einer Ausbeute von 7 % gelang. Mit der Einführung der neuen Synthese ergaben sich noch weitere Vorteile.

Sie ist zuverlässiger als die alte; Ausbeuten von 0 % traten deutlich seltener auf als vorher. Die Chromatographie war zwar immer noch aufwendig, aber einfacher als bisher, da deutlich weniger Verunreinigungen bei der Reaktion entstanden. Die Reaktionsdurchführung wurde wesentlich erleichtert, Koevaporieren nach den Einzelschritten war nicht mehr erforderlich. Bisher mussten erhebliche Mengen an PMEA-Diethylester 36 eingesetzt werden, um nur geringe Mengen an cyclo-Amb-PMEA-Prodrugs darzustellen. Im Vergleich muss nun deutlich weniger PMEA 9 verwendet werden, um ausreichende Mengen an Zielverbindungen für die Charak-terisierung und antivirale Tests zur Verfügung zu haben.

Bei allen Vorteilen, die die neue Synthese mit sich brachte, stellte sich die Frage, warum trotz dieser eleganten Reaktionsführung bei der Literatursynthese von HepDirect Prodrug 51 nur 40 % und bei der neuen Synthese von cycloAmb-PMEA 31a nur 33 %

Ausbeute erzielt wurden. Im Vergleich mit der Synthese anderer PMEA-Prodrugs sind diese Ausbeuten eigentlich relativ gut. Trotzdem sollte untersucht werden, ob Nebenprodukte identifiziert werden können. Deshalb wurde die Reaktion durch ³¹ P-NMR verfolgt. Es wurde die Synthese von 3-Me-cycloAmb-PMEA 31b untersucht.

(ppm)

-10 -5

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

N

Abb. 34 ³¹P-NMR-Spektrum von Zwischenprodukt 50a

Abb. 34 zeigt das ³¹P-NMR-Spektrum des ersten Syntheseschrittes. Die Probe wurde nach drei Stunden direkt aus der Reaktionslösung entnommen. Das Spektrum zeigt die Bildung eines einzigen Produktes. Das Edukt PMEA 9 oder phosphorhaltige Verunreini-gungen sind nicht zu erkennen. Das bedeutet, dass das Zwischenprodukt 50a unter den gewählten Reaktionsbedingungen quantitativ gebildet wird, ohne dass bemerkenswerte Nebenreaktionen auftreten. Der erste Syntheseschritt kann demzufolge für die Ausbeuteverluste nicht verantwortlich sein und bedarf deshalb keiner weiteren Untersuchung. Abb. 35 zeigt das ³¹P-NMR-Spektrum des zweiten Syntheseschrittes.

N N N

N N

O P O ClCl

50a

(ppm)

-10 -5

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

N

Abb. 35 ³¹P-NMR-Spektrum des zweiten Syntheseschrittes (Kupplung)

Die Probe wurde der Reaktionslösung entnommen, nachdem der Kupplungsschritt der Reaktion über Nacht von -80 °C auf Raumtemperatur erwärmt war. Dabei sind neben Zwischenprodukt 54 eine Vielzahl von Verunreinigungen deutlich zu erkennen, die beim Kupplungsschritt entstanden sein müssen. Bei der Betrachtung der Integrale ist zu erkennen, dass nur noch ungefähr 30 % des gewünschten Produktes vorhanden war.

Dabei ist anzumerken, dass es sich bei der Zuordnung in Abb. 35 nur um eine Ver-mutung handelt, die plausibel ist und auf Erfahrungen beruht. Ein endgültiger Beweis wurde hier nicht geliefert, da die Verbindung 54 als reine Referenzsubstanz für einen Vergleich nicht zur Verfügung stand. Dem NMR-Spektrum kann entnommen werden, dass der Kupplungsschritt ausschlaggebend für die relativ niedrigen Ausbeuten ist.

Welche Nebenreaktionen für diesen erheblichen Verlust verantwortlich sind, wurde nicht weiter untersucht, da die Anzahl von Nebenprodukten sehr unübersichtlich war. Auf dieser Stufe der Reaktion wurden auch Dünnschichtchromatogramme auf Kieselgelfolien angefertigt. Hier konnte nur ein intensiver Spot beobachtet, der einen Rf -Wert im Bereich lipophiler Verbindungen hatte. Vermutlich handelte es sich um das gewünschte Produkt. Der Großteil der Verunreinigungen blieb auf der Grundlinie des

N N N

N N

O P O

54 NH

O

?

Chromatogrammes liegen, über deren Entstehung nur wage spekuliert werden kann.

Abb. 36 zeigt das ³¹P-NMR-Spektrum, das nach zwei Stunden unter Entschützungs-bedingungen aufgenommen wurde.

(ppm)

-10 -5

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

N N N

N

NH₂

O P

31b O NH

O

Abb. 36 ³¹P-NMR-Spektrum des dritten Syntheseschrittes (Entschützung)

Hier konnte aus der Vielzahl der Produkte das gewünschte Produkt eindeutig identifiziert werden, da Verbindung 31b als Referenz vorhanden war. Sein Anteil betrug ungefähr 20 - 30 %, vermutlich ist etwas Produkt durch die Entschützung verloren-gegangen, allerdings nicht in dem Ausmaß wie beim Kupplungsschritt. Im Spektrum sind deutlich drei intensive Signale von Verunreinigungen zu erkennen, eines bei ca. 5 ppm und zwei zwischen 13 und 14 ppm. Da die dünnschichtchromatographischen Analysen erneut sehr polare Verunreinigungen zeigten, wurde auf ihre Isolierung verzichtet, da dies erheblichen Aufwand erfordern würde. Schon die Isolierung der lipophileren und damit chromatographierbaren cycloAmb-PMEA-Prodrugs war mit erheblichem Aufwand verbunden.

Mit der ³¹P-NMR-spektroskopischen Verfolgung der neuen Prodrug-Synthese konnte gezeigt werden, dass der Hauptverlust an Produkt beim Umsetzen des Phosphon-säurechlorids mit der lipophilen Maske auftritt. Wie es zu diesem Verlust kommt oder

welche Nebenreaktionen dafür verantwortlich sind, ist unklar. Eine mögliche Erklärung ist, dass durch teilweise Entschützung der Adenin-NH2-Gruppe Nebenreaktionen auftraten, da Formamidinschutzgruppen unter basischen Bedingungen mit Nucleophilen abgespalten werden können. Auf weitere Untersuchungen oder gar Reaktionsoptimie-rungen wurde verzichtet, da die Hauptaufgabe dieser Arbeit die Prodrugoptimierung war.

Die Einführung der neuen Synthese für cycloAmb-PMEA-Prodrugs brachte erhebliche Vorteile gegenüber der alten mit sich. Sie ist deutlich zuverlässiger, es werden wesentlich höhere Ausbeuten erzielt, und die Isolierung der Zielverbindungen ist weniger zeitaufwendig, da die Chromatographie etwas angenehmer ist. Diese Synthese ist somit geeignet, die für die Prodrugoptimimierung erforderlichen Zielverbindungen in ausreichender Menge zu liefern.

Im Dokument Nucleosidphosphonat-Prodrugs auf Basis des cycloSal-Konzepts (Seite 42-50)