Durchflusszytometrie zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten

Wert von etwa 5^.10⁴ Rezeptoren pro Zelle, den Lee et al. beschrieb¹⁴⁰, übereinstimmt und das dreimaliges Passagieren der Zellen keinen Einfluss auf deren Rezeptorexpression darstellt.

Abbildung 37: Übersicht der Ergebnisse zur quantitativen Durchflusszytometrie. Die Anzahl der CCR5-Rezeptoren pro Zelle sind für alle vermessenen Zellen angeführt (grau: Zellen, schwarz: Zellen mit monoklonalem Antikörper).

einem Fluorophor markiert ist, konnte das One-Site-Binding-Modell an die Datenpunkte angepasst und somit die Dissoziationskonstante ermittelt werden.

Es wurden GHOST(3)-Hi5-Zellen mit Lösungen von 2+Cy3 mit den Konzentrationen von 10 mM, 1 mM, 500 µM, 100 µM, 10 µM, 1 µM, 500 nM und 100 nM vermessen. Als Negativkontrollen dienten einerseits Parentalzelllösungen mit 10 mM und 100 nM 2+Cy3, als auch die beiden Zellarten ohne Peptidlösung. Es wurden Messungen mit Zellkonzentrationen von 1^.10⁶ Z/mL durchgeführt.

Bei den Messungen wurden in den SSC-A/FSC-A-Dotplots gates gelegt, um nur die lebendigen Zellen zu berücksichtigen. Die Messungen der Zellen sind als Dotplots, in denen der PE-A-Kanal gegen den FITC-A-Kanal aufgetragen ist, dargestellt (Abbildung 38). In den Dotplots ist ersichtlich, dass zwei Zellpopulationen vorlagen. Die Zellpopulation der Quadranten Q1 und Q3 sind GFP-negativ, wohingegen die Zellpopulation im Quadranten Q2 bzw. Q4 GFP-positiv ist. Um Fehler in der Bestimmung der Dissoziationskonstanten auszuschließen, wurden nur die Zellen im Quadranten Q1 bzw. Q3 der Dotplots und deren mittlere Fluoreszenzintensitäten in den Histogrammen abgebildet, die sie keine Autofluoreszenz aufwiesen. Aus den Histogrammen des PE-A-Kanals und den Quadranten Q1 und Q3 der Dotplots geht hervor, dass die Fluoreszenz mit sinkender Peptidkonzentration abnimmt, bis bei einer Konzentration von 10 µM keine Fluoreszenz im PE-A-Kanal mehr observiert werden kann. Da ab dieser Konzentration keine Fluoreszenz mehr detektiert wurde, sind Ergebnisse der niedrigeren Konzentrationen nicht mit angefügt.

Dotplot: GHOST(3)-Hi5 mit 10 mM 2+Cy3 Histogramm: GHOST(3)-Hi5 mit 10 mM 2+Cy3

Dotplot: GHOST(3)-Hi5 mit 1 mM 2+Cy3 Histogramm: GHOST(3)-Hi5 mit 1 mM 2+Cy3

Dotplot: GHOST(3)-Hi5 mit 500 µM 2+Cy3 Histogramm: GHOST(3)-Hi5 mit 500 µM 2+Cy3

Dotplot: GHOST(3)-Hi5 mit 100 µM 2+Cy3 Histogramm: GHOST(3)-Hi5 mit 100 µM 2+Cy3

Dotplot: GHOST(3)-Hi5 mit 10 µM 2+Cy3 Histogramm: GHOST(3)-Hi5 mit 10 µM 2+Cy3

Abbildung 38: Dotplots (PE-A/FITC-A) und Histogramme (PE-A-Kanal) der Messung von GHOST(3)-Hi5-Zellen gefärbt mit einer Konzentrationsreihe von 10 mM, 1 mM, 500µM, 100 µM, 10 µM des Peptids 2+Cy3. In den Histogrammen sind die mittleren Fluoreszenzintensitäten der Zellen in den Quadranten Q1 und Q3 abgebildet.

Um eine unspezifische Wechselwirkung ausschließen zu können, wurden zwei Negativkontrollen durchgeführt. Einerseits wurden nur Zellen ohne Peptidlösung vermessen, was in Abbildung 39 dargestellt ist. Bei den Negativkontrollen treten im FITC-A-Kanal des Dotplots zwei Populationen auf, es liegen aber nirgends PE-positive Zellpopulationen vor. Aus den Histogrammen (PE-A-Kanal) geht hervor, dass die Zellen PE-negativ sind.

Dotplot: GHOST(3)-Hi5 Histogramm: GHOST(3)-Hi5

Dotplot: Parental Histogramm: Parental

Abbildung 39: Negativkontrolle der durchflusszytometrischen Bestimmung der Dissoziationskonstanten.

Dotplots (PE-A/FITC-A) und Histogramme des PE-A-Kanals von GHOST(3)-Hi5- und Parentalzellen, die nicht mit 2+Cy3 gefärbt wurden. In den Histogrammen sind die mittleren Fluoreszenzintensitäten der Zellen in den Quadranten Q1 und Q3 der Dotplots abgebildet.

Um die Spezifität der Wechselwirkung zu untersuchen, wurden andererseits auch Parentalzellen, die mit Peptidlösungen der Konzentrationen von 10mM und 100 nM gefärbt wurden, vermessen (Abbildung 40). Parentalzellen, die mit 10 mM 2+Cy3 gefärbt wurden, waren PE-positiv. Im Histogramm der Quadranten Q1 und Q3 ist die mittlere Fluoreszenzintensität jedoch geringer als die der GHOST(3)-Hi5-Zellen, die ebenfalls mit der gleichen Konzentration von 10 mM 2+Cy3 gefärbt wurden. Bei der Konzentration von 10 µM 2+Cy3 zeigen die Parentalzellen kein Signal im PE-A-Kanal.

Dotplot: Parental mit 10 mM 2+Cy3 Histogramm: Parental mit 10 mM 2+Cy3

Dotplot: Parental mit 10 nM 2+Cy3 Histogramm: Parental mit 10 nM 2+Cy3

Abbildung 40: Dotplots (PE-A/FITC-A) und Histogramme (PE-A-Kanal) der Negativkontrolle der durchflusszytometrischen Messung der Dissoziationskonstanten. Es wurden Parentalzellen, die mit Peptidlösungen mit Konzentrationen von 10 mM und 100 nM gefärbt wurden, vermessen. In den Histogrammen sind die mittleren Fluoreszenzintensitäten der Quadranten Q1 und Q3 abgebildet.

Diese Negativmessung zeigt, dass das Peptid 2+Cy3 auch unspezifische Wechselwirkungen mit den Zellen eingeht. Die mittlere Fluoreszenzintensität der Messung mit GHOST(3)-Hi5-Zellen und einer Ligandkonzentration von 10 mM liegt bei 9617, die Intensität der gleichen Peptidkonzentration mit Parentalzellen liegt bei 2112. Dementsprechend geht aus diesen Mittelwerten hervor, dass die Wechselwirkung zu ungefähr 20% unspezifisch ist. Dies ist nicht weiter verwunderlich, da sowohl das Fluorophor als auch das Peptid einen hohen hydrophoben Charakter aufweisen und daher eine unspezifische Interaktion mit beispielsweise der Zellmembran eingehen können.

Da die Zellen ab einer Ligandkonzentration von 2 µM keine Anfärbung mehr zeigten, war es nicht möglich, eine eindeutige graphische Darstellung der mittleren Fluoreszenzintensitäten gegen die Peptidkonzentrationen zu erhalten. Diese Messung diente dementsprechend als Anhaltspunkt, in welchem Konzentrationsbereich nachfolgende Messungen erfolgen mussten.

Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der Ligand 2+Cy3 zu 20% unspezifische Wechselwirkungen mit den vermessenen Zellen eingeht.

Aus diesem Grund wurde erneut eine Messung zur Bestimmung der Dissoziationskonstante durchgeführt. Diesmal wurden die Konzentrationen des Cy3-markierten Peptids den Ergebnissen der vorangegangenen Messung angeglichen. Es wurden Zellen, die mit der Konzentrationsreihe von 12.0, 9.6, 7.7, 6.6, 3.1, 1.3, und 0.8 mM des Peptids 2+Cy3 gefärbt wurden, vermessen. Als Negativkontrolle diente eine Messung von ungefärbten GHOST(3)-Hi5-Zellen. Die Zellkonzentrationen betrugen jeweils 1^.10⁶ Z/mL. Dabei wurde im SSC-A/FSC-A-Dotplot ein gate gelegt, um nur die lebendigen Zellen zu berücksichtigen. Im PE-A/FITC-A-Dotplot wurden GFP-positive Zellen ausgeschlossen, um die starke Autofluoreszenz auszuschließen und nur die mittlere Fluoreszenzintensität der GFP-negativen Zellen zu betrachten. Die Histogramme des PE-A-Kanals (Abbildung 41) zeigen eine deutliche Abhängigkeit der Fluoreszenzintensitäten von den Ligandkonzentrationen. In einigen Histogrammen ist eine Schulter zu verzeichnen, die auf die Spektralüberlappung und dessen unzureichende Kompensation im FITC-A-Kanal zurückzuführen ist. Daher wurde eine Beschränkung vorgenommen, so dass nur die mittlere Fluoreszenzintensität im P4-gate in der Auswertung berücksichtigt wurde.

Histogramm: GHOST(3)-Hi5 mit 12.0 mM 2+Cy3 Histogramm: GHOST(3)-Hi5 mit 9.6 mM 2+Cy3

Histogramm: GHOST(3)-Hi5 mit 7.7 mM 2+Cy3 Histogramm: GHOST(3)-Hi5 mit 6.6 mM 2+Cy3

Histogramm: GHOST(3)-Hi5 mit 3.1 mM 2+Cy3 Histogramm: GHOST(3)-Hi5 mit 1.3 mM 2+Cy3

Histogramm: GHOST(3)-Hi5 mit 0.8 mM 2+Cy3 Histogramm: GHOST(3)-Hi5, Negativkontrolle

Abbildung 41: Histogramme zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten. Es wurden Zellen, die mit der Konzentrationsreihe von 12.0, 9.6, 7.7, 6.6, 3.1, 1.3, und 0.8 mM des fluoreszenzmarkierten Peptids 2+Cy3 gefärbt wurden, vermessen. Als Negativkontrolle diente eine Messung der ungefärbten GHOST(3)-Hi5-Zellen. Nur Zellen im P4-gate wurden berücksichtigt.

Die vermessenen mittleren Fluoreszenzintensitäten des P4-gates wurden gegen die Konzentrationen des fluorophormarkierten Peptids aufgetragen und das One-Site-Binding-Modell an die Datenpunkte angepasst (Abbildung 42).

Abbildung 42: Berechnung der thermodynamischen Dissoziationskonstanten K_D des fluoreszenzmarkierten Peptids 2+Cy3. Es wurden die mittleren Fluoreszenzintensitäten gegen die Ligandkonzentrationen aufgetragen und das One-Site-Binding-Modell an die Datenpunkte angepasst.

Aus der Auftragung der Abbildung 43 ergibt sich ein K_D von 21 ± 32 mM. Die Fehler der B_max- und K_D-Werte liegen jedoch sehr hoch und auch die angepasste Funktion weist eine hohe mittlere Abweichung auf, weshalb ein zusätzlicher künstlicher Datenpunkt zur Stabilisierung in die Auftragung mit einbezogen wurde. Dazu wurde der errechnete B_max-Wert von 100000 (Abbildung 42) bei einer hohen Konzentration gesetzt. Da die Konzentration, bei der eine Sättigung der mittleren Fluoreszenzintensität vorliegt, nur geschätzt werden konnte, wurden zwei Graphen mit einerseits einer Ligandkonzentration von 100 mM (Abbildung 43a) und andererseits mit einer Konzentration von 200 mM (Abbildung 43b) aufgestellt und das One-Site-Binding-Modell an die Datenpunkte angepasst.

(a) (b)

Abbildung 43: Berechnung der Dissoziationskonstanten des Peptids 2+Cy3. Es wurden die mittleren Fluoreszenzintensitäten gegen die Ligandkonzentrationen aufgetragen und jeweils ein künstlicher Datenpunkt gesetzt. Dieser Datenpunkt liegt in beiden Graphen bei einer mittleren Fluoreszenzintensität von 100000. Die Konzentration, bei der eine Sättigung der Fluoreszenz auftritt, wurde in der Berechnung (a) auf 100 mM und in (b) auf 200 mM gesetzt. Das One-Site-Binding-Modell wurde an die Datenpunkte angepasst.

Die daraus resultierende Dissoziationskonstante liegt im Graphen (a) bei 31 ± 6 mM und im Graphen (b) bei 25 ± 4 mM und ist somit in der gleichen Größenordnung des Wertes der vorherigen Auftragung in Abbildung 42. Die B_max-Werte liegen mit 111894 – 130168 der mittleren Fluoreszenzintensität in dem Bereich, der als Sättigungsintensität vorgegeben wurde.

Der B_max-Wert der Auftragung mit einer Sättigungsligandkonzentration von 200 mM liegt jedoch näher an dem vorab definierten Wert und weist auch einen niedrigeren Fehler auf.

Daher ist davon auszugehen, dass die Sättigungskonzentration des Liganden bei 200 mM liegt und somit eine Dissoziationskonstante K_D von 25 mM aufweist.