Auf der unteren rechten Bildh¨ alf-te erkennt man die ¨uber das Thiol an das Gold angeheftete DNS. Die Molek¨ule bewegen sich im Live-Bild in Zitterbewegungen um ihren Anheftungspunkt.
4.3 Anbindung der DNS an Gold
Abb. 4.7: DNS auf Chromoxid an der Glas/
Chromoxid/Gold-Grenzfl¨ache:
Diagonal in der Bildmitte ist der Chromoxid-Streifen zu erkennen, auf dem keine DNS haftet. Links oben ist DNS auf Glas, rechts un-ten im Bild auf Gold gebunden, die unterschiedlichen Bindungsty-pen sind hier gut unterscheidbar.
im Gegensatz zu den gestreckten Strukturen aus Abbildung 4.4 zu erkennen ist. Bildlich ist daher ein
”DNS-Wald“ aus der Vogelperspektive zu sehen. Die nach oben stehenden Molek¨ule sind zum großen Teil noch verkn¨ault, bewegen sich aber in Zitterbewegungen um ihren An-heftungspunkt. Im Live-Bild unter dem Mikroskop ist daher der Unterschied zu einem reinen Glassubstrat deutlich an dieser Bewegung erkennbar. Oben links in der Abbildung nimmt wiederum die DNS-Konzentration ab, da hier der ¨Ubergang zur anderen Schicht beginnt.
Die Glas/Gold-Substrate wurden in der Aufdampfanlage hergestellt, in der die Glassub-strate teilweise abgedeckt wurden, um so die Kantenstruktur zu erhalten. F¨ur Gold ist auf Glas allerdings eine d¨unne Chromschicht als Haftvermittler n¨otig. Aufgrund der Geometrie der Aufdampfanlage gibt es zwischen Glas und Gold beim ¨Ubergang einen schmalen Streifen 5 nm dicken Chroms, welches bei Bel¨uftung der Anlage nach den beiden Bedampfungsschrit-ten oxidiert. Das Chromoxid deckt die unges¨attigten OH-Gruppen des Glassubstrates ab, bietet aber selbst keine Bindungsm¨oglichkeiten f¨ur das Thiol am Ende des DNS-Strangs. In Abbildung4.7ist dieser schmale Chromoxidstreifen zu sehen, er ist dunkel, da fast keine DNS an ihm gebunden ist. Links oben ist wiederum die Glasoberfl¨ache mit dem
”DNS-Teppich“ zu erkennen, rechts unten der spezifisch an das Gold gebundene
”DNS-Wald“.
F¨ur einen weiteren Anheftungsversuch wurde eine Glas/Polyimid-Kante auf einem Glas-substrat gefertigt. Dieser Versuch sollte das Verhalten von DNS auf Polyimid im Gegensatz zu Glas charakterisieren. Die zugrundeliegende Fragestellung bei diesem Test war, inwieweit man eine Behandlung der Glasoberfl¨ache zur Verhinderung von unspezifischer DNS-Anheftung vor-antreiben sollte oder ob vielmehr eine Optimierung der Lithographie auf Polyimid anzusetzen ist. Polyimid ist chemisch inert, hat keine freien Molek¨ulgruppen und h¨alt großen mechani-schen Belastungen stand. In Abbildung 4.8 ist die Polyimid/Glas-Grenzschicht abgebildet.
Wie erwartet ist die Polyimidschicht links unten v¨ollig frei von DNS, wobei auf Glas das bekannte Verhalten zu erkennen ist. Hierbei ist zun¨achst nicht klar, ob auf Polyimid wirklich keine DNS bindet oder ob seine leicht gelbliche F¨arbung den einstrahlenden blauen Lichtstrahl beziehungsweise das gr¨une Streulicht der YOYO-Molek¨ule absorbiert. Bei Aufpipettierung ei-ner hochkonzentrierten DNS-L¨osung auf das Polyimid ohne Absp¨ulen wurde jedoch eindeutig gr¨unes Fluoreszenzlicht beobachtet. Somit ist es eindeutig, dass Polyimid keine DNS bin-det, daher sollte die Lithographie auf Substraten mit vorhandener Polyimidschicht optimiert werden. Polyimid hat sich durch diese Tests als bisher bester Untergrund erwiesen.
Abb. 4.8: DNS auf Polyimid:
Links unten befindet sich das Poly-imid, auf dem keine DNS-Molek¨ule haften. In der rechten oberen Bild-h¨alfte zeigt sich wieder das bekann-te Haftungsverhalbekann-ten auf einer un-behandelten Glasschicht.
Als weitere Tests zur Anbindung von DNS bieten sich nun Gold/Polyimid-Substrate auf Glas oder auch Kombinationen von Silizium und Gold mit und ohne Polyimidschicht an. Somit kann das Bindungsverhalten von (oxidiertem) Silizium im Vergleich zu Polyimid und Glas charakterisiert werden. Aus Zeitgr¨unden konnten diese Tests in der vorliegenden Diplomarbeit nicht mehr durchgef¨uhrt werden, lassen sich aber im Anschluss daran schnell verwirklichen.
Offen dabei bleibt immer noch die Frage, wie sich das Streckverhalten von DNS auf Polyimid im Gegensatz zu den aus der Literatur bekannten Daten auf Glas ver¨andert.
4.4 Streckung der DNS und Leitf¨ ahigkeitsmessungen
Wie aus den ersten drei Abschnitten dieses Kapitels ersichtlich, konnten Streckexperimente und Leitf¨ahigkeitsmessungen nicht mehr im Rahmen dieser Diplomarbeit durchgef¨uhrt wer-den.
Als Vorbereitung f¨ur sp¨atere Messungen diente der in Kapitel 3.6 beschriebene Proben-halter, mit dem ein elektrisches Feld ¨uber die DNS-Proben angelegt werden konnte. Da der Arbeitsabstand des ¨Olimmersionsobjektivs sehr gering war (unter 1 mm), aber die Fixierung der Probe sehr stabil gegen Durchbiegen sein musste, wurde der Halter aus Plexiglas sehr eng an das Objetiv gef¨uhrt. Dadurch kam der ¨Oltropfen auf dem Objektiv stets mit dem Halter in Ber¨uhrung und floss ¨uber ihn ab. Deshalb konnte auf diese Weise keine im elektrischen Feld gestreckte DNS detektiert werden.
Da auch die Anheftung der DNS auf Gold noch zus¨atzlicher und intensiver Forschungsar-beit bedarf, wurden zun¨achst keine weiteren Streckexperimente durchgef¨uhrt. Die n¨achsten Schritte auf diesem Gebiet, sowie bei der anschließenden Leitf¨ahigkeitsmessung werden in Kapitel 6erl¨autert.
5 Zusammenfassung
In dieser Diplomarbeit wurden die Grundlagen zur weiteren Erforschung der Leitf¨ahigkeit der DNS erarbeitet. Bei der Miniaturisierung integrierter Schaltungen in der Mikroelektronik k¨onnte eine leitf¨ahige DNS beispielsweise einen großen Nutzen darstellen (Kapitel1und2.2).
Die chemische und r¨aumliche Struktur der DNS wurde in einem kurzen ¨Uberblick dargelegt (Kapitel2.1). Sie besteht aus einem zweistr¨angigen Zucker-Phosphat-R¨uckgrat, welches wen-deltreppenartig zu einer Doppelhelix verdreht ist. In der Mitte der Helix stehen Basenpaare aus Adenin und Thymin sowie Guanin und Cytosin, die jeweils ¨ubereinanderliegende Ebenen bilden. Diese Ebenen k¨onnen durch mechanischen Zug (Stress) leicht gegeneinander verdreht werden. Planare Strukturen aus ringf¨ormigen Aromaten zeichnen sich oft durch schwach ge-bundene Elektronen inπ-Orbitalen aus, die zu einer Stromleitung beitragen k¨onnen. Durch Kontrolle dieses Stressfaktors und somit des Verkippungsgrades der DNS wird somit eine Leitf¨ahigkeitsmessung unter mechanischer Belastung m¨oglich.
Der Stand der bisherigen Forschung wurde vorgestellt (Kapitel2.4). Das Spektrum der Er-gebnisse von Leitf¨ahigkeitsmessungen bei DNS geht von einem guten Stromleiter ¨uber Halb-leiter, Tunnelstromkontakt, Supraleiter bei tiefen Temperaturen bis hin zum Isolator. Dies gibt Anlass zur Annahme, dass ihre Leitf¨ahigkeit stark von weiteren Faktoren (Verteilung der Basenpaare, mechanischer Zug/Spannung, chemische Umgebung, etc.) abh¨angt, die bei einer aussagekr¨aftigen Messung mitkontrolliert werden m¨ussen.
Mittels optischer und Elektronenstrahllithographie wurden Leiterbahnen aus Gold auf Glas-und Siliziumsubstraten der Gr¨oße 24 mm mal 24 mm hergestellt, die es erlauben, DNS mit unterschiedlichen Streckungsgraden anzuheften (Kapitel3.3). Die Dimensionen der Struktu-ren liegen außen bei 2 mm Kantenl¨ange und innen bei 1µm Linienbreite. Dabei stellte sich heraus, dass optische Lithographie im UV-Licht auf Mikroskop-Deckgl¨asern aus Bor-Silikat nur befriedigend mit einer 2µm dicken Zwischenschicht aus Polyimid gelingt. Die nat¨urliche Unebenheit einer solchen Schicht erschwert dagegen die Lithographie im Rasterelektronen-mikroskop. Die Schichtdicke und Beschaffenheit des Polyimids und die Belichtungsparameter der Elektronenstrahllithographie m¨ussen aufeinander abgestimmt werden.
Die Anheftung der DNS an Gold erfolgt ¨uber Thiolgruppen (HS-Bindungen) an organi-schen Molek¨ulen (Kapitel 3.4,3.5 und 4.3). Die im Ausgangszustand ringf¨ormige DNS wird linearisiert und ¨uber ein Oligo-Molek¨ul an eine Thiolgruppe gebunden, welche direkt an ei-ne Goldoberfl¨ache heftet. Nach einer Anheftung erfolgt die Streckung im elektrischen Feld oder im Fluss eines Fl¨ussigkeitsmeniskus (Kapitel3.6). Die Detektion der mit einem Fluores-zenzfarbstoff markierten DNS-Molek¨ule erfolgt im Mikroskop (Kapitel3.7). Die Kontrolle der Anheftungs- und Streckungsparameter ist bisher nicht m¨oglich, daher konnten im Rahmen dieser Diplomarbeit noch keine Leitf¨ahigkeitsmessungen durchgef¨uhrt werden.
6 Ausblick und Kritik
Im letzten Kapitel wird ein Ausblick gegeben, welche M¨oglichkeiten sich im Anschluss an diese Diplomarbeit bieten. Zugleich sollen Inhalt und Ergebnisse sowie ihr Zustandekommen kritisch beleuchtet werden.
Im Laufe des experimentellen Teils dieser Arbeit traten einerseits einige vorher nicht be-dachte Probleme auf, die teilweise noch weiterhin ungel¨ost sind. Andererseits ergaben sich v¨ollig neue Fragestellungen, deren Bearbeitung sicherlich Stoff f¨ur weitere Forschungsarbei-ten liefern. Desweiteren konnte das Thema der vorliegenden Arbeit aus Zeitgr¨unden nicht abschließend behandelt werden, somit besteht auch hier noch ausreichend Potenzial f¨ur zu-s¨atzliche Forschungsarbeit. Diese Arbeit war die erste Diplomarbeit zum Transport durch Molek¨ule im Fachbereich Physik der Universit¨at Konstanz. Daher mussten viele pr¨aparative Methoden erst erarbeitet werden, bevor zu den eigentlichen Messungen ¨ubergegangen werden kann.
Als Anmerkung sei vorangestellt, dass die Bearbeitung eines solchen Themenkomplexes sicherlich in einer mehrk¨opfigen Forschungsgruppe besser aufgehoben w¨are als in einer ein-zelnen Diplomarbeit, um so das Wissen ¨uber beispielsweise trickreiche Probenpr¨aparation zu sammeln und ¨uber l¨angere Zeitr¨aume zu optimieren. Die Themen daraus entstehender Diplomarbeiten w¨aren somit viel besser eingrenzbar und k¨onnten durch intensivere Besch¨ afti-gung mit nur einem Unterkomplex (z. B. Herstellung guter Goldstrukturen, Charakterisierung von Substratoberfl¨achen, Optimierung der DNS-Pr¨aparation, Aufbau einer Streck- und Mess-aparatur, etc.) erfolgreichere Ergebnisse liefern.
Die erste experimentelle Schwierigkeit in dieser Arbeit war die Optimierung der optischen Lithographie. Zwar konnte sie durch die Polyimidschicht auf den Glassubstraten verbessert werden, wodurch das urspr¨ungliche Problem der fehlerhaften Lackentwicklung und der daraus resultierenden Schwierigkeiten beim Lift-Off auf reinem Glas jedoch ungel¨ost blieb. Folgen-de Fragen sind noch offen: Worin liegt das unterschiedliche Verhalten von Siliziumdioxid als reines Glas und einer auf der Oberfl¨ache eines Siliziumsubstrates liegenden Oxidschicht be-gr¨undet? Spielen (R¨uck-)Reflexionen an der Lack-Glas-Grenzfl¨ache auf den Substraten bei der Lithographie eine so große Rolle, dass es zu Fehlbelichtungen kommt? Wie groß ist die Restleitf¨ahigkeit von oxidierten Siliziumsubstraten? Wie hoch absorbierend beziehungsweise brechend ist der durchsichtige Teil der optischen Maske auf dem Kleinbildfilm f¨ur UV-Licht?
Desweiteren fehlt noch die Optimierung der Parameter bei der Elektronenstrahllithographie auf die Polyimidschicht. Warum gelingt hier die Belichtung nicht identisch wie auf reinen Siliziumproben und auf Polyimid auf metallischen Substraten?
Sollte auf die Polyimidschicht nicht verzichtet werden k¨onnen, ergibt sich als neue Frage-stellung, wie sich die DNS darauf verh¨alt. L¨asst sie sich dehnen und ¨uberstrecken wie auf reinem Glas/Gold oder
”klebt“ sie unspezifisch (das heißt nicht nur ¨uber die Thiolgruppen) auf der Polyimidunterlage? Dieser Prozess ist bisher v¨ollig unbekannt, erste Anzeichen liegen jedoch vor, dass Polyimid als Unterlage gut geeignet ist und keine DNS bindet.
Bei der Verwendung von oxidierten Siliziumsubstraten muss neben den lithographischen Problemen die Detektion unter dem Mikroskop optimiert werden. W¨ahrend die Detektion der DNS im Dunkelfeld mit dem Blau-/Gr¨un-Filtersatz bekannt ist, war dagegen die Justierung des Sichtfeldes auf die Goldstrukturen im Rot-/Rot-Filter schwierig. Da Glas und oxidiertes Silizium bei der Lithographie unterschiedliches Verhalten zeigten, ist auch ein ver¨andertes Verhalten von DNS auf einem Siliziumsubstrat denkbar.
Ein weiterer Aspekt, der bei fortgesetzter Erforschung unseres Erbguts gr¨undlich untersucht werden muss, ist die chemische Behandlung der DNS, um sie f¨ur die Anheftung an Gold zu pr¨aparieren. Das bisher unzureichend kontrollierbare Ankleben an Gold kann zwei Gr¨unde ha-ben. Zun¨achst k¨onnte die Ligation der Oligonukleotide an die linearisierte DNS nur fehlerhaft erfolgt sein. Das heißt, dass sich die Phosphatbindung zwischen Oligo undλ-DNS im R¨ uck-grat nicht ausgebildet hat. Der Fehler hierf¨ur w¨are in einer nicht erfolgten Phosphorylisierung des Oligo-Molek¨uls zu suchen. In diesem Fall w¨aren bei der Reinigung der DNS in der NICK-R¨ohre alle Oligos ausgesp¨ult worden und in der DNS-Stamml¨osung w¨aren keine Thiolgruppen mehr vorhanden und nachweisbar. Der zweite Grund k¨onnte in einer nicht erfolgten Thiol-bindung an die Goldoberfl¨ache liegen. In diesem Fall w¨aren die Bedingungen, unter denen die Thiolgruppen an das Gold heften, experimentell zu bestimmen. Eventuell muss daf¨ur die gesamte chemische Vorbereitung der DNS in einer nicht oxidierenden Atmosph¨are erfolgen, beziehungsweise m¨ussen die Oligo-Molek¨ule nach der Lieferung zuerst reduziert werden.
Bevor wirklich Leitf¨ahigkeitsmessungen an DNS erfolgen k¨onnen, sollte große Energie in die Gewinnung neuer Erkenntnisse ¨uber ihr Streckverhalten investiert werden. Bisher ist es nicht gelungen, DNS in verschiedenen Streckungsgraden zwischen 1,0 und 1,6 zu dehnen. Unter der Annahme, dass dies prinzipiell m¨oglich ist, ergeben sich folgende Forschungsfragen: Ist der Streckungsgrad abh¨angig von Substrateigenschaften (Rauigkeit, hydrophob oder hydrophil, etc.) oder bestimmt das Substrat nur die Zeit, die f¨ur die Streckung ben¨otigt wird? H¨angt der Streckfaktor vom pH-Wert ab? L¨asst er sich ¨uber Salzzugabe und somit ¨uber die Visko-sit¨at beeinflussen oder ist es m¨oglich, dass die Kraft, die ben¨otigt wird, um ein DNS-Molek¨ul aus einem Fl¨ussigkeitstropfen herauszul¨osen, immer so groß ist, dass sie die Streckkraft f¨ur maximale Dehnung von 80 pN stets ¨ubersteigt und somit nur ein Streckfaktor von 1,6 zu-stande kommt? Daf¨ur k¨onnte es n¨utzlich sein, die Streckversuche mit der AFM-Spitze zu reproduzieren.
Die bereits angesprochenen weiterf¨uhrenden Experimente zu Leitf¨ahigkeitsmessungen an DNS, die diese Arbeit vervollst¨andigen w¨urden, m¨ussen realisiert werden. Nach gelungener Anheftung und Streckung der DNS auf Gold ist eine Halterung zu entwerfen, in die die quadratischen Substrate eingespannt werden k¨onnen. Mittels Federkontaktstiften an jedem Kontaktpad auf dem Substrat ließe sich beispielsweise in einem Aufbau der elektrische Durch-gang jeder einzelnen Leiterbahn pr¨ufen und danach zwischen den gew¨unschten Kontakten die Spannung anlegen. Ein solcher Probenhalter k¨onnte ¨ahnlich dem Belichtungshalter f¨ur die optische Lithographie wieder aus PVC mit eingelassenen Kontaktstiften konstruiert werden.
Somit w¨are eine identische und fixierte Stellung jeder Probe gew¨ahrleistet.
Zum Schluss dieses Ausblicks sollen die M¨oglichkeiten dargelegt werden, die sich zuk¨unftig aus diesem Themenkomplex ergeben k¨onnen:
Wenn alle bisher erw¨ahnten Experimente erfolgreich durchgef¨uhrt sind, ließe sich der vor-handene Aufbau einfach modifizieren, um beispielsweise synthetisch hergestellte Poly-G–Poly-C–DNS zu vermessen und somit einen direkten Vergleich mitλ-DNS aus Bakterien unter sonst identischen Bedingungen zu schaffen. Daf¨ur m¨ussten die Innenabst¨ande der Goldstrukturen auf die unterschiedliche Konturl¨ange abgestimmt werden. Aber auch anderweitig modifizierte
DNS (z. B. starre Basenpaare ohne die M¨oglichkeit der Verkippung unter mechanischem Zug) k¨onnte untersucht werden. An das R¨uckgrat k¨onnten ebenso andere Ionen oder Metallatome angelagert werden und anschließend untersucht werden, ob deren Leitf¨ahigkeit die der DNS dominiert oder ob sich beide Werte in ¨ahnlichen Gr¨oßenordnungen bewegen.
Bei Kontrolle dieser Parameter und unter der Voraussetzung, dass DNS eine messbare Leitf¨ahigkeit in einer bestimmten Konformation besitzt, k¨onnte man letztendlich ¨ Uberlegun-gen anstellen, einzelne DNS-Str¨ange in bestimmte Bahnen zu legen und so erste einfachste Schaltungen auf der Nanometerskala zu realisieren. Dazu m¨usste nat¨urlich eine Einzelstrang-kontrolle der DNS auf einem isolierenden Substrat (vielleicht mit einem AFM) entwickelt werden.
R¨uckblickend muss festgestellt werden, dass der Titel dieser Arbeit,
”Leitf¨ ahigkeitsmes-sungen an DNS unter mechanischer Belastung“, den zeitlichen Rahmen einer Diplomarbeit gesprengt hat. Da die Forschung an diesem Themengebiet am Fachbereich Physik der Uni-versit¨at Konstanz noch am Anfang steht und Ergebnisse aus der Literatur keinesfalls trivial reproduzierbar sind, dient diese Arbeit eher als Vorbereitung, sich weiter mit den Eigen-schaften der DNS zu besch¨aftigen. Durch sie wurden die Schwierigkeiten dieser Fragestellung erst aufgezeigt und verdeutlicht. Das Hauptergebnis der vorliegenden Diplomarbeit ist daher die Erkenntnis, dass es sich lohnt, auf diesem Gebiet weitere Forschungsarbeit zu investie-ren. Allerdings in dem Bewusstsein, sich nur in sehr kleinen Schritten dem Ziel n¨ahern zu k¨onnen, zumal hier teilweise Techniken aus der Biologie/Chemie ben¨otigt werden, die in der
”Standard-Physik“ bisher noch wenig bekannt sind. Bei Aufteilung in verschiedene Unterar-beiten k¨onnten sich auf der Grundlage dieser Arbeit sicherlich bald Erfolge in der Erforschung des Erbgutes einstellen.
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Danksagung
Diese Diplomarbeit entstand am Fachbereich Physik der Universit¨at Konstanz. F¨ur die wun-derbare Zeit meines Studiums am Bodensee bedanke ich mich bei allen Mitarbeitern und Studierenden.
Meinen besonderen Dank m¨ochte ich FrauProf. Dr. E. Scheerf¨ur die herzliche Aufnah-me in ihre Arbeitsgruppe und die Korrektur dieser Diplomarbeit ausdr¨ucken. Frau Scheer war stets am Fortschritt und der Entwicklung meiner Experimente interessiert sowie immer gerne bereit, mich tatkr¨aftig zu unterst¨utzen. Durch ihre Ratschl¨age, Erkl¨arungen und Kri-tik hat mir die Bearbeitung meiner Diplomarbeit ¨uber das ganze Jahr viel Spaß und Freude bereitet. Ich habe vieles gelernt und einen tollen Einblick in die wissenschaftliche Forschung erhalten.
Danken m¨ochte ich HerrnProf. Dr. G. Maretf¨ur die ¨Ubernahme des Koreferats. Ebenso geht ein Dankesch¨on an seinen MitarbeiterThomas Gisler, der mir bei Fragen zur Chemie beigestanden hat aber mir dennoch viele Freiheiten in der experimentellen Umsetzung ließ.
Ein weiteres offenes Ohr fand ich beiRoman Lehner, wenn es um Tipps und Tricks bei der Handhabung der DNS ging. FrauLaxbin ich wegen ihres großen ¨Uberblicks im Chemielabor
Ein weiteres offenes Ohr fand ich beiRoman Lehner, wenn es um Tipps und Tricks bei der Handhabung der DNS ging. FrauLaxbin ich wegen ihres großen ¨Uberblicks im Chemielabor