Leitfähigkeitsmessungen an DNS unter mechanischer Belastung

Leitf¨ ahigkeitsmessungen an DNS unter mechanischer Belastung

Diplomarbeit angefertigt von Roland Hackl

Arbeitsgruppe Prof. Dr. E. Scheer Fachbereich Physik

Universit¨ at Konstanz

Juli 2002

Erkl¨ arung

1. Ich versichere hiermit, dass ich die anliegende Arbeit mit dem Thema:

Leitf¨ahigkeitsmessungen an DNS unter mechanischer Belastung

selbst¨andig verfasst und keine anderen Hilfsmittel als die angegebenen benutzt habe.

Die Stellen, die anderen Werken dem Wortlaut oder dem Sinn nach entnommen sind, habe ich in jedem einzelnen Fall durch Angaben der Quelle, auch der benutzten Sekun- d¨arliteratur, als Entlehnung kenntlich gemacht.

2. Diese Arbeit wird nach Abschluss des Pr¨ufungsverfahrens der Universit¨atsbibliothek Konstanz ¨ubergeben und ist durch Einsicht und Ausleihe somit der ¨Offentlichkeit zu- g¨anglich. Als Urheber der anliegenden Arbeit stimme ich diesem Verfahren zu.

Konstanz, 22. Juli 2002

Roland Hackl

Inhaltsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis iii

1 Einleitung 1

2 Motivation und Stand der Forschung 3

2.1 Die DNS: Aufbau und Struktur . . . 3

2.2 M¨oglicher Nutzen leitf¨ahiger DNS. . . 5

2.3 Theoretische ¨Uberlegungen zur Leitf¨ahigkeit von DNS . . . 6

2.4 Bisherige Experimente anderer Forschergruppen. . . 7

2.4.1 Streckexperimente . . . 8

2.4.2 Experimente zur Leitf¨ahigkeit . . . 9

DNS als elektrischer Leiter . . . 9

DNS als Halbleiter . . . 9

Tunnelstrom in DNS . . . 10

DNS als Supraleiter . . . 10

DNS als Isolator . . . 10

DNS als Tr¨agermaterial f¨ur Leiterstrukturen . . . 10

2.5 Probleme bisheriger Experimente . . . 11

3 Experimentelles 13 3.1 Idee und Grundgedanke . . . 13

3.2 Voraussetzungen . . . 14

3.3 Lithographische Probenherstellung . . . 15

3.3.1 Optische Lithographie . . . 16

3.3.2 Verbesserungen bei der optischen Lithographie . . . 19

3.3.3 Elektronenstrahllithographie . . . 20

3.4 Chemische Vorbereitung der DNS. . . 22

3.5 Anheftung von DNS an ein Substrat . . . 24

3.6 Streckung der DNS . . . 25

3.7 Detektion . . . 26

3.8 Leitf¨ahigkeitsmessung . . . 26

4 Ergebnisse 27 4.1 Optische Lithographie . . . 27

4.2 Elektronenstrahllithographie. . . 27

4.3 Anbindung der DNS an Gold . . . 28

4.4 Streckung der DNS und Leitf¨ahigkeitsmessungen . . . 32

5 Zusammenfassung 33

6 Ausblick und Kritik 35

Literaturverzeichnis 39

Danksagung 41

Abbildungsverzeichnis

1.1 Miller-Versuch . . . 1

1.2 Entwicklung der Miniaturisierung in der Chipherstellung . . . 2

2.1 Schematische Struktur der DNS-Doppelhelix . . . 3

2.2 Struktur des Ribosezuckers . . . 3

2.3 Die vier Basen der DNS . . . 4

2.4 Schematische Struktur des DNS-R¨uckgrates . . . 4

2.5 Teilung der DNS . . . 5

2.6 Dehnungsverhalten der DNS. . . 7

2.7 Streckung der DNS im Fl¨ussigkeitsmeniskus . . . 8

3.1 Gesamtansicht der Maske f¨ur die optische Lithographie. . . 17

3.2 Innenansicht der Maske f¨ur die optische Lithographie . . . 17

3.3 Halter f¨ur den optischen Belichtungsprozess . . . 18

3.4 Ubersicht ¨¨ uber eine defekte Grobstruktur . . . 19

3.5 Defekte Grobstruktur an einer Verj¨ungungsstelle . . . 20

3.6 Zoom in eine defekte Grobstruktur . . . 20

3.7 Schreibvorlage f¨ur die Elektronenstrahllithographie . . . 21

3.8 Struktur eines Oligo-Molek¨uls . . . 22

3.9 Phosphorylisiertes Oligo-Molek¨ul . . . 23

3.10 Ringf¨ormigeλ-DNS . . . 23

3.11 Linearisierte λ-DNS . . . 23

3.12 Angelagertes Oligo an DNS . . . 24

3.13 Vollst¨andig an DNS gebundenes Oligo . . . 24

3.14 Setup zum Strecken von DNS im Fl¨ussigkeitsmeniskus . . . 25

4.1 Ergebnis der optischen Lithographie . . . 27

4.2 Ergebnis der Elektronenstrahllithographie . . . 28

4.3 DNS unspezifisch angeheftet . . . 29

4.4 Gestreckte DNS-Str¨ange . . . 29

4.5 DNS auf Glas . . . 30

4.6 DNS auf Gold. . . 30

4.7 DNS auf Chromoxid an der Glas/Chromoxid/Gold-Grenzfl¨ache . . . 31

4.8 DNS auf Polyimid . . . 32

1 Einleitung

Nachdem sich im Laufe ihrer Entwicklung die Naturwissenschaft in die drei zun¨achst sehr abgegrenzten Teilbereiche Chemie, Biologie und Physik untergliedert hat, gibt es durch den technischen Fortschritt der letzten Jahrzehnte immer wieder und immer neue Ber¨uhrungs- punkte.

In der Chemie wurde begonnen, aus einfachen Molek¨ulen gr¨oßere und komplexere Struk- turen zu entwickeln bis hin zum Verst¨andnis von Makromolek¨ulen, wie sie in der Biologie von Bedeutung sind. Ein bekanntes Beispiel hierf¨ur ist der Versuch vonStanley L. Miller (University of Chicago, Beginn der 50er Jahre), bei dem unter Bedingungen, wie sie zu Be- ginn des Lebens auf unserem Planeten geherrscht haben, aus Atomen und anorganischen Molek¨ulen organische Substanzen und sogar Fragmente des Erbgutes aller Lebewesen (vor allem Aminos¨auren) synthetisiert wurden (Abb. 1.1).

Abb. 1.1: Miller’scher Versuchsaufbau:

Der Versuch stellt eine Rekonstruktion der

”Ur- atmosph¨are“ und der

”Ursuppe“ zu Beginn des Lebens auf der Erde dar. Aus anorganischen Edukten entstehen im Reaktionsgef¨aß unter elek- trischen Entladungen organische Substanzen [1].

In der Biologie gewinnen neben dem chemischen Verst¨andnis der Biomolek¨ule immer mehr auch ihre physikalischen Eigenschaften an Bedeutung, da sie zur Entwicklung neuer Theorien und Modelle herangezogen werden m¨ussen.

In der Physik kommt man aus der entgegengesetzten Richtung. Ziel ist es hier, beispiels- weise in der Mikrolektronik immer kleinere Strukturen zu erhalten, um hierbei einen Ge- schwindigkeitszuwachs in der Schalt- und Regeltechnik zu erhalten (Abb.1.2). Dabei werden heutzutage elektronische Bauteile quasi

”von oben“ (top down), durch Strukturierung vom Groben zum immer Feineren (Lithographie, ¨Atzen, etc.) gefertigt. Die absehbare Grenze in der Miniaturisierung dieses Verfahrens (z. B. durch die Wellenl¨ange des verwendbaren Lichts bei der Lithographie) ist bald erreicht. In der Physik wird daher nun ¨uber die M¨oglichkeit nachgedacht, auch hier eine Strukturierung

”von unten“ (bottom up) mit Hilfe von Biomo- lek¨ulen durchzuf¨uhren. Damit ist ein Schnittpunkt mit der Biologie erreicht und somit eine

Abb. 1.2: Entwicklung der Miniaturisierung in der Chipherstellung:

F¨ur immer leistungsf¨ahigere Com- puter werden die Strukturen auf den Chips immer kleiner. Bisheri- ge lithographische Methoden errei- chen bald ihre Grenzen und m¨us- sen duch neuere Herstellungsver- fahren ersetzt werden.

Begr¨undung geliefert, sich als Physiker mit den physikalischen Eigenschaften von DNS zu besch¨aftigen.

Aus chemischer und biologischer Sicht ist DNS ein sehr großes Molek¨ul, aber der Durch- messer eines solchen DNS-Stranges ist mit ungef¨ahr 20 ˚A immer noch viel kleiner als derjenige heutzutage verwendeter Dr¨ahte und Leiterbahnen in der Physik. Damit liegt dieses Molek¨ul im Bereich der Mesoskopie, da es nicht mehr mikroskopisch auf atomarer Skala und noch nicht makroskopisch im Festk¨orperbereich anzusiedeln ist.

Die einfachste Fragestellung, die sich ein Physiker bei der Charakterisierung eines neuen Stoffes stellen kann, ist neben der Untersuchung seiner mechanischen Eigenschaften (Dichte, H¨arte, Phasenverhalten, etc.), die Messung der elektrischen Leitf¨ahigkeit.

Erste theoretische ¨Uberlegungen zur Leitf¨ahigkeit gr¨oßerer Biomolek¨ule gab es schon Ende der 50er und Anfang der 60er Jahre [2], kurz nachdem die r¨aumliche Struktur vieler solcher Substanzen aufgekl¨art war. Trotzdem ist die elektrische Leitf¨ahigkeit speziell der DNS bis heute noch ungekl¨art. Auch wurden erst in j¨ungerer Zeit neue mechanische Eigenschaften der DNS bez¨uglich ihrer Dehnbarkeit [3, 4, 5] sowie strukturelle Konstitutions¨anderungen innerhalb dieses Molek¨uls [6] nachgewiesen.

In dieser Arbeit wird ein neuer Ansatz zur Leitf¨ahigkeitsbestimmung von DNS vorgestellt, bei dem die mechanischen und elektrischen Eigenschaften dieses Molek¨uls miteinander ver- kn¨upft werden. Im folgenden Kapitel wird genauer auf die Struktur der DNS, ihren Aufbau und ihr mechanisches Verhalten eingegangen sowie ein ¨Uberlick ¨uber den bisherigen Stand der Forschung geliefert. In Kapitel3 werden ausf¨uhrlich die experimentelle Idee dieser Arbeit vorgestellt sowie Probenherstellung und Versuchsaufbau dargelegt. Erste Ergebnisse dieses Projekts finden sich in Kapitel 4. Am Schluss werden die weiteren M¨oglichkeiten dargelegt, die sich im Laufe dieser Diplomarbeit ergeben haben und die als Motivation f¨ur weitere Ex- perimente dienen k¨onnen.

2 Motivation und Stand der Forschung

2.1 Die DNS: Aufbau und Struktur

Seit der Aufkl¨arung der chemischen und r¨aumlichen Struktur der DNS durchJames Watson undFrancis Crickim Jahre 1953 [7] l¨asst das Interesse an diesem Molek¨ul nicht nach. Die Abk¨urzung DNS steht f¨ur Desoxyribonukleins¨aure (engl.: desoxyribonucleic acid, DNA), ein Molek¨ul in Doppelhelix-Struktur, aus dem das Erbgut aller Lebewesen aufgebaut ist (Abbil- dungen2.1und 2.4).

Abb. 2.1: Schematische Struktur der DNS-Doppelhelix:

Das Bild zeigt die Doppelhelix-Struktur mit dem Zucker-Phosphat-R¨uckgrat. Die Basen bilden im Inneren die

”Stufen“ einer Wendeltreppe. Sie sind planar ¨ubereinander ausgerichtet und ¨uber Wasserstoff-Br¨ucken miteinander verbunden [8].

Das ”R¨uckgrat“ unseres Erbguts besteht aus einer zweistr¨angigen Zucker-Phosphat-Struk- tur; der sogenannte Desoxyribose-Zucker (Abb. 2.2) ist ringf¨ormig und enth¨alt f¨unf Kohlen- stoffatome. Die Anbindung an das Phosphat erfolgt am dritten und f¨unften Kohlenstoffatom, demnach werden die Enden der Helix als 3’- beziehungsweise 5’-Ende bezeichnet.

Am ersten C-Atom des Rings h¨angt jeweils eine der vier Basen Adenin,Thymin,Guanin undCytosin (Abb.2.3). Die Basen sind im Inneren der Doppelhelix ¨uber Wasserstoff-Br¨ucken

Abb. 2.2: Struktur des Ribosezuckers:

Der Ribosezucker besteht aus einem F¨unfer-Ring aus vier C- und einem O-Atom. Die Bindung zum Phosphat erfolgt am 3. und 5. C-Atom. Die Bin- dung an das Stickstoff-Atom der jeweiligen Base erfolgt am 1. C-Atom [9].

Adenin Thymin Guanin Cytosin Abb. 2.3: Die vier Basen der DNS: Die Anbindung an den Ribosezucker erfolgt am linken

unteren Stickstoff-Atom (N-1 bei Thymin und Cytosin, N-9 bei Adenin und Gua- nin) [9].

an die Basen des gegen¨uberliegenden Helix-Stranges angebunden. Dabei erfolgen die Bindun- gen nicht willk¨urlich, sondern nur paarweise jeweils zwischen den Basen A-T sowie G-C.

Andere Paarungen der Basen w¨urden zu einer Verzerrung der r¨aumlichen Struktur der DNS f¨uhren. Die Bindung C-T w¨are zu kurz, die Bindung G-A wiederum zu lang. Die von der Bin- dungsl¨ange passenden Bindungen A-C und G-T w¨urden keine effizent bindenden Wasserstoff- Br¨ucken aufbauen (siehe auch Abb.2.4). Der Abstand der Basenpaare untereinander betr¨agt etwa 3,4 ˚A, eine

”Windung“ der Doppelhelix wird aus 10 ¨ubereinanderliegenden Basenpaaren formiert. Der Durchmesser des DNS-Stranges liegt bei etwa 20 ˚A. Die DNS, die in dieser Ar- beit verwendet wurde, ist die sogenannte λ-DNS. Diese λ-DNS besteht aus einer zuf¨alligen Abfolge von Basenpaaren, wie sie auch in der Natur vorkommt, im Gegensatz zu beispielswei- se synthetisch hergestellter Poly-G–Poly-C–DNS, die nur aus Guanin-Cytosin-Basenpaaren besteht. Die verwendete Bakteriophagen-λ-DNS (Fermentas) ist zun¨achst ringf¨ormig und hat nach dem Aufbrechen des Ringes eine relaxierte Konturl¨ange (Nettol¨ange vom 3’- zum 5’-Ende) von knapp 16µm, was einer Anzahl von 48 503 Basenpaaren (BP) entspricht.

Abb. 2.4: Schematische Struktur des DNS-R¨uckgrates:

Das Bild stellt die

”auseinandergerollte“ Doppel- helix dar, die antiparallel ausgerichteten Str¨ange (3’–5’) sowie die Basenpaare und ihre Verkn¨up- fung ¨uber Wasserstoff-Br¨ucken [8].

2.2 M¨oglicher Nutzen leitf¨ahiger DNS

2.2 M¨ oglicher Nutzen leitf¨ ahiger DNS

Traditionelle Modelle zur Beschreibung des Reparaturmechanismus einzelner DNS-Fragmente nach beispielsweise Strahlensch¨aden oder der Replikation des gesamten Erbgutes bei der Zell- teilung, wie man sie z. B. aus der Schulbiologie kennt, liefern folgende Erkl¨arungen f¨ur den Teilungsvorgang: Die in den Chromosomen

”verkn¨aulte“ und

”aufgewickelte“ DNS wird lokal

”entknotet“. Bestimmte Enzyme brechen die Doppelhelix auf, andere wiederum duplizieren den zweiten Strang der DNS, indem sie einzelne DNS-Basen an ihre entsprechende Part- nerbase (A zu T beziehungsweise G zu C) anlagern. So entsteht wie an einer Weiche einer Eisenbahnschiene ein neuer Doppelstrang (Abb.2.5).

Abb. 2.5: Teilung der DNS:

Die beiden Str¨ange der parentalen (urpr¨ungli- chen) DNS werden durch Enzyme geteilt. Je- der Teilstrang spezifiziert jeweils einen neuen Tochterstrang aufgrund der Paarungsregeln. Aus einzelnen DNS-Basen, die frei in der Zelle bezie- hungsweise im Zellkern vorkommen, setzen En- zyme die Tochterstr¨ange an den Original-DNS- Strang. Die sich sofort ausbildenden Wasserstoff- Br¨ucken halten das neue Molek¨ul zusammen [9].

Selbst unter der Annahme, dass an vielen Stellen zugleich die DNS dupliziert wird, kann dieses Modell an der DNS ungerichtet entlang wandernder

”Replikationsenzyme“ die Ge- schwindigkeit, mit der die DNS-Verdopplung bei der Zellteilung gem¨aß neuerer Messungen voranschreitet, nicht erkl¨aren. Sollte sich die Hoffnung auf eine elektrische Leitf¨ahigkeit der DNS unter bestimmte Voraussetzungen erf¨ullen, ließe sich eventuell damit ein neues, besseres Modell der Zellteilung entwickeln. Elektronen, die sich l¨angs der DNS bewegen, k¨onnten so mit einer viel h¨oheren Geschwindigkeit Duplikationsprozesse induzieren.

DNS muss nicht nur bei der Zellteilung repliziert werden, sondern Sch¨aden am genetischen Code werden durch ¨ahnliche Prozesse wie oben beschrieben repariert. Die am h¨aufigsten vor- kommenden Gen-Sch¨aden sind kleinere Strahlungssch¨aden aufgrund der radioaktiven H¨ohen- strahlung oder Sch¨aden, die durch giftige Radikale (z. B. Nikotin, etc.) hervorgerufen werden.

Bei der Ausheilung solcher Defekte muss nicht die gesamte DNS repliziert werden, sondern nur fehlerhafte Teilst¨ucke. Diese Reparatur von Strahlensch¨aden ist in der Molekularbiologie noch sehr unverstanden, aber von großer Bedeutung. Ließen sich die Reparaturvorg¨ange aufgrund von dort fließenden Str¨omen leichter lokalisieren, w¨are in der Erforschung dieses Gebietes ein großer Fortschritt getan.

DNS ist ein hochkomplexes, aber dennoch selbstorganisierendes Molek¨ul. Durch Kontrolle dieses selbtsorganisierenden Wachstums k¨onnte man

”DNS-Nanodr¨ahte“ herstellen, die lang genug sind, um Schaltungen in integrierten Schaltkreisen zu konstruieren, aber dennoch nur eine Dicke von wenigen Nanometern besitzen. Mit dieser

”molekularen Elektronik“ w¨are ei- ne auf diese Art und Weise endg¨ultige Miniaturisierung von Schaltkreisen, wie sie z. B. auf

Computerchips eingesetzt werden, erreicht. Dabei gilt es aber zu beachten, dass die theore- tische Betrachtung molekularer Schaltkreise folgendes Problem aufwirft: Elektrische Leitung durch nanoskalierte Strukturen wird durch Quantenph¨anomene dominiert und somit verliert die klassische, theoretische Beschreibung der heutigen Mikroelektronik ihre G¨ultigkeit. Wege zum Verst¨andnis und Modelle zur Beschreibung von Schaltkreisen auf molekularer Basis zu finden, ist daher eine Herausforderung, der sich theoretische Physiker zur Zeit stellen und die in Zukunft weiter ausgearbeitet werden m¨ussen.

2.3 Theoretische ¨ Uberlegungen zur Leitf¨ ahigkeit von DNS

Wie bereits in Kapitel 2.1 beschrieben, ragen die DNS-Basen in die Mitte der Doppelhelix hinein. Sie haben eine relativ planare Struktur, so dass man bildlich von

”Treppenstufen“

sprechen kann. Jede Base enth¨alt 10 π-Elektronen, somit hat eine

”Treppenstufe“ ein Sys- tem von 20 π-Elektronen, das senkrecht zu ihrer planaren Struktur parallel zur Helixachse steht. Diese Struktur im Inneren der Achse erinnert an Graphit; Eley und Spivey neh- men daher an, dass DNS ein Verhalten wie ein eindimensionaler aromatischer Kristall zeigen k¨onnte [10]. F¨ur solch ein System sagt die Theorie halbleitende Eigenschaften voraus, bei 20 perfekt konjugiertenπ-Elektronen erg¨abe sich eine Energiel¨ucke von 1,5±0,5 eV, bei nur 10 zur Stromleitung beitragendenπ-Elektronen w¨are die Bandl¨ucke doppelt so groß. Der Un- terschied zu einer aromatischen Kristallstruktur liegt darin, dass beim Kristall derπ- ¨Uberlapp zwischen den pz-Elektronen innerhalb der Ebene betrachtet wird, w¨ahrend bei DNS die Leit- f¨ahigkeit durch einenσ- ¨Uberlapp der p_z-Elektronen zwischen den

”Treppenebenen“ l¨angs der Helixachse erfolgen muss.

Weitere theoretische ¨Uberlegungen zur Leitf¨ahigkeit von DNS zeigen, dass immer die π- Elektronen der Basenpaare involviert sind, daher wird sich im Folgenden auch nur auf diese π-Elektronen-Systeme bezogen.

Neuere Messungen von Elektronentransfer-Raten vonWangmit Hilfe von Femtosekunden- Spektroskopie zeigen einen stark nicht-exponentiellen Zerfall eines angeregten Zustandes einer DNS-Base mit sehr langen Zeitkonstanten [6]. Nach Anregung eines Elektrons in ein h¨oher- energetisches Orbital sind f¨ur die Relaxation folgende Bedingungen notwendig:

1. Auswahlregeln m¨ussen erf¨ullt sein.

2. Ein gen¨ugend großer r¨aumlicher ¨Uberlapp des angeregten Orbitals mit dem Grundzu- standsorbital muss vorhanden sein.

Unter der Annahme, dass Bedingung 1 erf¨ullt ist, lassen sich die langen nicht-exponentiellen Zerfallsraten dadurch erkl¨aren, dass die Basenpaare nicht immer zueinander parallele Ebenen bilden, sondern gegeneinander verkippt sind. Dies ist m¨oglich, da die C–N-Bindungen der Basen an den Ribosezucker Einfachbindungen sind, die sich l¨angs ihrer Achse beliebig drehen k¨onnen.

Bruinsma leitet daraus stark anharmonische strukturelle Fluktuationen der Basenpaare mit niedriger Frequenz im GHz-Bereich ab [11]. Diese Fluktuationen beschreiben die Ver-

¨anderung in der Verkippung der Basenpaare relativ zu ihrer Ruhelage, deren R¨uckstellkraft nicht linear zu ihrer Auslenkung ist. Nur in der richtigen Position kann der angeregte Zustand relaxieren. Das Verkippen der Basenpaare zueinander erfolgt mit sehr geringem Energieauf- wand. Dies zeigen Experimente von Bensimon und Cluzel [3, 4, 5]. Sie haben die Kraft

2.4 Bisherige Experimente anderer Forschergruppen

Abb. 2.6: Dehnungsverhalten der DNS:

In der N¨ahe ihrer relaxierten Kon- turl¨ange l¨asst sich die DNS feder- artig dehnen. Bei einer Zugkraft von etwa 80 pN findet man ein Kraftplateau, auf dem die DNS um einen Faktor von 1,1 bis 1,6 ge- dehnt ist. In diesem Bereich fin- den nachBruinsmadie anharmo- nischen Fluktuationen der Basen- paare statt [12].

(in pN) ¨uber der relativen Dehnung (relativ zur relaxierten Konturl¨ange) von DNS-Str¨angen bestimmt (Abb. 2.6). Man findet ein interessantes Verhalten: Im Bereich um die relaxier- te Konturl¨ange (im hier vorliegenden Fall: ≈ 16µm) l¨asst sich die DNS durch ein lineares Kraftgesetz mit einer Federkonstanten beschreiben. Das Dehnen und Relaxieren ist nahezu beliebig wiederholbar. Ab einer relativen ¨Uberstreckung von 1,1 gibt es ein Kraftplateau bei etwa 80 pN, auf dem sich die DNS fast ohne zus¨atzlichen Kraftaufwand bis zu einer ¨Uber- dehnung von 1,6 strecken l¨asst. Auch in diesem Bereich ist die DNS beliebig oft dehn- und relaxierbar. Mehr als um den Faktor 1,6 l¨asst sich unser Erbgut nicht strecken, bei h¨oherer Krafteinwirkung reisst der DNS-Strang ab.

Dieses zun¨achst unerwartete Verhalten wird folgendermaßen interpretiert: Die Dehnung auf dem Kraftplateau um die Zugkraft von 80 pN beruht auf dem Verkippen der Basenpaare in der Doppelhelix. Die Tiefe einer

”Treppenstufe“ aus zwei DNS-Basen ist gr¨oßer als ihre H¨ohe.

Dreht sich nun ein Basenpaar um bis zu 90^◦, sind gerade diese beiden Dimensionen vertauscht und die DNS verl¨angert sich.

Allerdings ist aus diesem Experiment nicht ersichtlich, ob die Verkippung kontinuierlich zwischen 0^◦ und 90^◦ erfolgen kann oder ob es ein Zweizustands-Prozess ist, bei dem sich jedes einzelne Basenpaar entweder gar nicht oder vollst¨andig dreht. Somit w¨are ein Streckfaktor von 1,3 auf zwei Arten denkbar: Alle Basenpaare sind im statistischen Mittel um 45^◦verkippt oder im statistischen Mittel sind die H¨alfte aller DNS-Basen in ihrer Ursprungslage und die andere H¨alfte um den vollen Winkel gedreht.

Andere theoretische Forschergruppen postulieren eher ein isolierendes Verhalten unseres Erbguts [13] oder nur einen Tunnelstrom [14], wobei dort die Elektronen nur von G-C zu G- C-Basenpaaren h¨upfen, der Strom also vom Konzentrationsverh¨altnis A-T zu G-C abh¨angt.

Diese widerspr¨uchlichen theoretischen ¨Uberlegungen spiegeln sich in den unterschiedlichen experimentellen Ergebnissen wieder, wie sie im n¨achsten Abschnitt dargelegt, daher kann bis jetzt noch keine Theorie zur Leitf¨ahigkeit endg¨ultig best¨atigt oder widerlegt werden.

2.4 Bisherige Experimente anderer Forschergruppen

In diesem Abschnitt wird auf bereits durchgef¨uhrte Experimente in anderen Forschungsgrup- pen eingegangen, die einerseits die Idee und die Grundlagen f¨ur den in dieser Arbeit realisierten experimentellen Aufbau liefern, aber andererseits nicht identisch mit diesem Vorhaben sind.

Dabei soll nicht bis in jedes einzelne Detail dieser Experimente vorgedrungen werden, sondern die prinzipielle Idee dahinter verdeutlicht werden. Die beiden Aspekte der Dehnbarkeit der DNS und ihrer Leitf¨ahigkeit werden in den folgenden zwei Abschnitten getrennt behandelt.

2.4.1 Streckexperimente

In w¨assrigem Medium liegt DNS grunds¨atzlich in einer kompakten, verkn¨aulten Struktur vor.

In der Literatur werden mit Dehnung und Streckung daher zwei zun¨achst unabh¨angige Vor- g¨ange bezeichnet: Zun¨achst einmal muss die DNS auf ihre relaxierte Konturl¨ange

”entkn¨ault“

oder”entwirrt“ werden. Dabei ¨andert sich jedoch nichts an der inneren Struktur der Doppel- helix. Dennoch braucht dieser Prozess Energie, denn die Wasserstoff-Br¨ucken, die die DNS in ihrer verkn¨aulten Struktur halten, m¨ussen aufgebrochen werden. Wie bereits erw¨ahnt, zeigt die DNS in diesem Bereich ein federartiges Kraft-Antwort-Verhalten. Da beim Zusammen- kn¨aulen die aufgebrochenen Wasserstoff-Br¨ucken wieder aufgebaut werden, ist dieser Vorgang reversibel.

Ist die DNS bereits auf ihre relaxierte Konturl¨ange gestreckt, beginnt bei weiterer Kraftein- wirkung der Bereich der sogenannten ¨Uberdehnung oder ¨Uberstreckung. Wie schon in Abb.2.6 gezeigt, l¨asst sich die DNS bis auf das 1,6-fache ihrer Ursprungsl¨ange dehnen. Vergleicht man dies beispielsweise mit einem Gummiband, ist das ein erstaunliches Resultat. Erstaunlich vor allem deshalb, weil einerseits auch dieser Prozess reversibel ist, obwohl hierbei im Inneren der DNS strukturelle Ver¨anderungen auftreten, als auch andererseits keine große zus¨atzliche Zugkraft erforderlich ist, um die ¨Uberstreckung herbeizuf¨uhren.

Das im Prinzip einfachste Experiment, um dieses Verhalten zu testen, ist die Spitze eines atomaren Kraftmikroskops (Atomic Force Microscope, AFM) dicht ¨uber eine L¨osung mit DNS zu f¨uhren und hinein zu tunken, bis ein DNS-Strang gen¨ugend fest an der Spitze haf- tet. Beim Herausziehen der Spitze bleibt der verkn¨aulte Teil der DNS aufgrund hydrophiler Wechselwirkung mit dem L¨osungsmittel m¨oglichst lange in der L¨osung, die DNS wird so auf ihre Konturl¨ange gedehnt. Heftet man nun das zweite Ende der DNS fest an ein Substrat an, wird man anschließend den ¨uberstreckten Bereich der Kraft-Dehnungs-Kurve aufnehmen k¨onnen. Experimente dieser Art wurden unter anderem in der Gruppe von Professor Gaub am CeNS der Technischen Universit¨at M¨unchen durchgef¨uhrt.

Die hydrophilen Wechselwirkungen der DNS mit ihrer w¨assrigen L¨osung geben die M¨oglich- keit, die DNS noch auf eine weitere Art zu strecken: Wiederum wird ein Ende der DNS an ein Substrat angeheftet. Die Anheftung an sich wird in Kapitel 3.5 noch genauer erl¨autert. Die DNS-L¨osung bildet auf einem Substrat einen Fl¨ussigkeitstropfen mit einem Meniskus. L¨asst man nun den Meniskus kontrolliert in eine Richtung wegfließen oder verdampfen, wird sich der frei bewegliche Teil der DNS m¨oglichst lange im Tropfen halten. Der DNS-Teil außerhalb des Meniskus ist dann getreckt (Abb. 2.7). Bei diesem Experiment l¨asst sich die Streckkraft, wenn auch sehr schwierig, prinzipiell ¨uber die Eigenschaften des Substrates, die Oberfl¨a- cheneigenschaften und Viskosit¨at des L¨osungsmittels sowie die Verdampfungsgeschwindigkeit

Abb. 2.7: Streckung der DNS im Meniskus:

Ein Ende der DNS ist am Substrat angeheftet. Sie wird beim gerich- teten Verdampfen des Fl¨ussigkeits- meniskus gestreckt [15].

2.4 Bisherige Experimente anderer Forschergruppen

kontrollieren. Dabei muss zun¨achst ein Eichexperiment zur Ermittlung des Streckfaktors aus den Substrat- und L¨osungsmitteleigenschaften durchgef¨uhrt werden, wobei die Kontrolle der erhaltenen Dehnung unter dem Mikroskop erfolgt. Experimente dieser Art wurden in ver- schiedenen Gruppen durchgef¨uhrt [16,17].

Wird DNS in L¨osung gebracht, dissoziieren die am ¨außeren Ger¨ust sitzenden Endgruppen als Ionen in das L¨osungsmittel. Die Ladung entspricht etwa zwei Elementarladungen pro Basenpaar. Bei mehreren zehntausend Basenpaaren pro DNS-Molek¨ul ist so ein Strang sehr hoch geladen. Dies er¨offnet die M¨oglichkeit, DNS im elektrischen Feld zu strecken. In der Literatur findet man Werte f¨ur das hierf¨ur ben¨otigte elektrische Feld in der Gr¨oßenordnung von 2 bis 6 V/cm. Bei der Verwendung einer Gleichspannung muss ein Ende der DNS ebenfalls wieder angeheftet werden. Das andere Ende richtet sich dann l¨angs des elektrischen Feldes aus.

Aber auch mit Wechselspannung mit einer Frequenz von einigen bis einigen hundert Kilo- hertz kann DNS gestreckt werden. Bei diesen Frequenzen reagiert der DNS-Strang an sich zu tr¨age. Die viel kleineren Ionen in der w¨assrigen L¨osung sind dagegen viel mobiler. Sie bewegen sich sehr schnell im Wechselfeld hin- und her und richten so durch St¨oße die langen Str¨ange der DNS mit der Zeit l¨angs des elektrischen Feldes aus. Den Grad der Dehnung bestimmen in beiden F¨allen die St¨arke des elektrischen Feldes, das Substrat, auf dem die L¨osung aufgebracht ist und die Zeit, in der das Feld auf die DNS-Molek¨ule einwirken kann.

2.4.2 Experimente zur Leitf¨ahigkeit DNS als elektrischer Leiter

Zwei Experimente und ihre Ergebnisse sollen kurz vorgestellt werden:

Von Tran et al. wurde wie in dem hier vorliegenden Experiment Bakteriophagen-λ-DNS untersucht. Die DNS wurde sowohl mit als auch ohne Pufferl¨osung Frequenzen im Mikrowel- lenbereich ausgesetzt. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen eine gute elektrische Leit- f¨ahigkeit bei Raumtemperatur, aber eine starke Abnahme bei tiefen Temperaturen. Ohne Hydrath¨ulle wurde allerdings eine geringere Leitf¨ahigkeit nachgewiesen [18].

Mit identischerλ-DNS wurde ihre Leitf¨ahigkeit vonDouglasgemessen. In seinem Experi- ment wurden DNS-Str¨ange zwischen Gold-Elektroden gespannt, ¨ahnlich wie es auch in diesem Versuchsaufbau vorgesehen ist. Wie beim Streckexperiment mit dem Fl¨ussigkeitsmeniskus wurde die DNS auf die Elektroden als Substrat aufgebracht, ohne jedoch eine Aussage ¨uber den Streckfaktor zu machen. Das Ergebnis dieses Experiments zeigt fast perfekt Ohm’sches Verhalten der untersuchten Proben, weshalb auf eine gute Leitf¨ahigkeit der DNS geschlossen wird [19].

DNS als Halbleiter

Ein eher halbleitendes Verhalten des DNS-Molk¨uls liefern zwei weitere Experimente:

Das Experiment von Porath et al., das eine große Bandl¨ucke eines Halbleiterverhaltens zum Ergebnis hat, benutzt ganz andere, aber daf¨ur sehr einheitliche DNS-Strukturen. Es wurden nur Poly-G–Poly-C–Str¨ange benutzt, die mit 30 Basenpaaren nur eine geringe L¨ange von 10,4 nm aufweisen. Bei dieser Struktur ist der ¨Uberlapp derπ-Elektronen einheitlich ¨uber das gesamte Molek¨ul. ¨Uber Streckfaktoren wurde auch hier keine Aussage gemacht [20].

In der Gruppe von Fink wurde die Leitf¨ahigkeit einiger 600 nm langer Einzelstr¨ange in Abh¨angigkeit des angelegten Potenzials untersucht. Die Ergebnisse lassen sich mit denjenigen

von (halb-)leitenden Polymeren vergleichen, woraus auf ein gutes Halbleiterverhalten geschlos- sen wird. Somit ließen sich mesoskopische elektronische Schaltungen ideal realisieren, da die L¨ange von DNS-Ketten ¨uber Gr¨oßenordnungen variiert werden kann [21].

Tunnelstrom in DNS

Eine eher tunnelstromartige Leitf¨ahigkeit zeigen wiederum Experimente, die sich genauer mit der Verteilung der Basenpaare A-T und G-C besch¨aftigen. Festgestellt wurde, dass positive Lochladungen sich stabiler auf einer G-C-Treppenstufe halten als auf einer Stufe aus einem A-T-Basenpaar. Soll nun diese Ladung entlang der Helix bewegt werden, kann sie ¨uber kurze Distanzen von G-C zu G-C tunneln. Dieses koh¨arente Tunneln wird auch

”superexchange“

genannt; dabei wird keine Energie mit dem Moluk¨ul ausgetauscht und die Ladung ist voll- kommen delokalisiert. Die Wahrscheinlichkeit f¨ur den Tunnelprozess sinkt rapide je weiter die G-C-Basenpaare voneinander entfernt sind. F¨ur Ladungstransport ¨uber weitere Strecken wird daher der

”Thermal-Hopping“-Mechanismus favorisiert, bei dem Ladungen thermisch angeregt werden und von Basenpaar zu Basenpaar h¨upfen. Diese Experimente geben ver- mehrt Hinweise darauf, dass die elektrische Leitf¨ahigkeit von DNS sowohl stark von ihrer Zusammensetzung als auch von ihrer mechanischen Belastung abh¨angt [14,22].

DNS als Supraleiter

Ein letztes Experiment, das eine Leitf¨ahigkeit von DNS als Ergebnis hat, stammt aus der Gruppe von Kasumov. Auch hier wurde eine stromleitende DNS gefunden, die Ergebnis- se zeigen einen Widerstand von weniger als 100 kΩ pro Molek¨ul bei 16µm langer λ-DNS.

Bei Kontaktierung der DNS mit supraleitenden Kontakten mit einer Sprungtemperatur von 1 Kelvin wurde sogar ein proximity-induziertes supraleitendes Verhalten gefunden, welches zeigt, dass DNS bis in den Millikelvin-Bereich leitf¨ahig bleiben kann [23].

DNS als Isolator

Weitere Experimente wollen nun eher ein isolatorisches Verhalten der DNS gemessen haben.

De Pablobegr¨undet dies damit, dass alle bisher vorgestellten Experimente St¨oreffekte bei der Messung kleiner Str¨ome durch immer vorhandene Gegenionen in w¨assriger L¨osung und Verunreinigungen in der DNS-L¨osung nicht ber¨ucksichtigen und keine genauen Modelle zur Stromleitung liefern. In seinem Experiment benutzt er ebenfalls 16µm lange λ-DNS und liefert Ergebnisse mit Widerst¨anden von 10⁶Ω pro Molek¨ul. Theoretische ¨Uberlegungen in seiner Arbeit unter der Annahme unendlich langer, saurer, trockener DNS sagen ebenfalls ein nichtleitendes Verhalten voraus [13].

Best¨atigt wurden diese Ergebnisse durch Messungen aus der Gruppe von Zhang, der, wie auch in dieser Arbeit vorgesehen, λ-DNS mittels Thiolbindungen an Goldzuleitungen angeheftet hat [24].

DNS als Tr¨agermaterial f¨ur Leiterstrukturen

Der letzte Aspekt in diesem Abschnitt bezieht sich nicht mehr auf die Leitf¨ahigkeit von DNS an sich, sondern gibt nur einen Ausblick, auf welche Art dieses Molek¨ul dennoch auf jeden Fall in diesem Gebiet einsetzbar ist. Unbestritten ist der Vorteil von DNS, auf nm-Skala wohldefinierte Strukturen zu bilden. Somit bietet sie die M¨oglichkeit, unabh¨angig von ihrem

2.5 Probleme bisheriger Experimente

elektronischen Verhalten als Ger¨ust f¨ur sogenannte

”Nanodr¨ahte“ zu dienen. Gelingt es, au- ßen an das Zucker-Phosphat-R¨uckgrat gezielt und wohldefiniert Atome aus stromleitenden Metallen zu platzieren, k¨onnten so elektrische Schaltungen mit bekannten Stromleitern in ei- ner neuen, viel kleineren Dimension verwirklicht werden. Solche

”Nano-Transistoren“ werden bereits in der Gruppe vonBen-Jacob untersucht [25],

”Nanodr¨ahte“ aus DNS als Tr¨ager f¨ur Palladium und Silber wurden ebenfalls bereits realisiert [26,27].

2.5 Probleme bisheriger Experimente

Die in Kapitel 2.4.2vorgestellten Experimente lassen bis jetzt keine definitive Entscheidung

¨uber die Leitf¨ahigkeit von DNS zu. Problematisch beim Vergleich dieser Arbeiten sind die zum Teil sehr unterschiedlichen Vorgehensweisen der verschiedenen Arbeitsgruppen, die auf die unterschiedlichen experimentellen M¨oglichkeiten zur¨uckzuf¨uhren sind.

In keinem Experiment zur Leitf¨ahgikeit wurden bisher die Resultate zur Dehnbarkeit, also zur inneren Struktur der DNS beachtet, obwohl quer durch alle Forschergruppen die Beteili- gung der π-Elektronen der Basenpaare an einer eventuellen Leitf¨ahigkeit unbestritten ist.

Ein m¨oglicher Ansatz zum besseren Verst¨andnis ist sicherlich, sich zun¨achst einmal auf einfachere, chemisch gut definierte Strukturen zu konzentrieren. Dies geschieht in den Experi- menten mit kurzer Poly-G–Poly-C–DNS. Allerdings scheint im Hinblick auf nanostrukturierte DNS-Strukturen beziehungsweise die weitere Erforschung des zellul¨aren Reparaturmechanis- mus die weitergehende Untersuchung von λ-DNS ebenfalls unabdingbar. Der n¨achste Schritt in diese Richtung ist also zun¨achst, die Strukturen innerhalb eines Leitf¨ahigkeitsexperiments bez¨uglich ihrer r¨aumlichen Anordnung und ihrer mechanischen Belastung pr¨azise zu charak- terisieren.

3 Experimentelles

3.1 Idee und Grundgedanke

In den Experimenten, die im Folgenden besprochen werden, sollen die Probleme, wie sie in Kapitel 2.5 dargelegt wurden, systematisch ausgeschaltet werden. Die Verbindung von kontrollierten Streck- und Leitf¨ahigkeitsuntersuchungen bietet die M¨oglichkeit, Nachteile einer ungewissen r¨aumlichen Ausdehnung und mechanischen Belastung auszuschließen und somit pr¨azisere Ergebnisse zu liefern.

Neue, noch nicht ver¨offentlichte Daten geben Anzeichen, dass der in Kapitel 2.1 erw¨ahnte Abstand der Basenpaare von 3,4 ˚A nicht fest ist, sondern recht großen Schwankungen un- terliegt [28]. Dies gibt Anlass zur Annahme, dass die Kontrolle dieser Schwankungen auch verl¨asslichere Ergebnisse bei Leitf¨ahigkeitmessungen ergeben wird.Porath und seine Grup- pe m¨ochten modifizierte DNS benutzen, bei der der Basenabstand durch starre Bindungen fest vorgegeben ist.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein experimenteller Setup entworfen, bei dem die Schwan- kungen der Basenabst¨ande durch den Streckfaktor kontrolliert werden. Der st¨orende Strom der stets vorhandenen Gegenionen wurde zwar nicht

”abgeschaltet“, er sollte aber keinen ver- f¨alschenden Einfluss auf das Messergebnis haben (siehe letzten Absatz dieses Abschnitts).

Verwendet wurde Bakteriophagen-λ-DNS; diese DNS kommt auch in der Natur vor, ihre Ei- genschaften h¨angen somit nicht explizit von eventuellen Parametern einer k¨unstlichen DNS- Synthese ab. Nat¨urlich kann hier eine Beeinflussung der Messdaten durch noch eventuell un- bekannte und daher unkontrollierte Eigenschaften der DNS nicht vollst¨andig ausgeschlossen werden.

Die Grundhypothese der vorliegenden Arbeit ist folgende: Im mechanisch nicht ¨uberstreck- ten, unbelasteten Bereich stehen die Basenpaare abgesehen von der Verdrehung ihrer pla- naren Ebene aufgrund der Helixstruktur ¨ubereinander. Die π-Orbitalkeulen oberhalb und unterhalb der Treppenstufen ¨uberlappen gut mit den Orbitalen der dar¨uber beziehungswei- se darunter liegenden Basenpaare. In dieser Position sollte ein Strom l¨angs der Helixachsen fließen k¨onnen. Bei weiter fortschreitender mechanischer Belastung nimmt der ¨Uberlapp der π-Elektronenorbitale immer weiter ab, da sie bei Verkippung der Basenpaare aus dem Inneren der Doppelhelix heraus gedreht werden. Demnach m¨usste eine vorhandene Leitf¨ahigkeit mit zunehmender Belastung mehr und mehr abnehmen.

Mit diesem Ansatz l¨asst sich auch das Problem denaturierter DNS bei Eintrocknung oder fehlender Pufferl¨osung umgehen. Es wurde immer gepufferte DNS in w¨assriger L¨osung, also in m¨oglichst nat¨urlicher Umgebung verwendet. Ein Puffer bewirkt, dass der pH-Wert, also die Konzentration der in der L¨osung vorhandenen H3O⁺-Ionen konstant bleibt. Die Pufferl¨osung besteht aus mindestens zwei H⁺-Akzeptoren oder -Donatoren, die durch Aufnahme oder Ab- gabe eines Protons von außen vorgegebene pH-Verschiebungen korrigieren, die beispielsweise durch von der DNS abdissoziierende Ionen hervorgerufen werden k¨onnen.

Um einzelne Quanteneffekte aufgrund der mesoskopisch kleinen Struktur eines Einzel-DNS- Stranges bei der Messung vernachl¨assigen zu k¨onnen, wird immer an einer Parallelschaltung von etwa 10⁴ DNS-Molek¨ulen gemessen. Bei dieser Messmethode k¨onnen rein klassische An- s¨atze verwendet werden, quantenmechanische Effekte verschwinden im Rauschen des Setups.

Dabei muss unterschieden werden zwischen dem quantenmechanischen

”H¨upfen“ von Elektro- nen zwischen einzelnen Basenpaaren, wie sie in einigen im vorhergehenden Kapitel beschrieben Theorien postuliert werden, und der Messung von Einzelleitf¨ahigkeit eines DNS-Stranges. Im ersten Fall wird ein Beitrag zur Gesamtleitf¨ahigkeit der DNS geleistet, w¨ahrend im zweiten Fall keine Messung relativ zum Untergrundrauschen m¨oglich ist.

Die in der L¨osung stets vorhandenen Ionen werden im Experiment immer einen Strom liefern; bei Ver¨anderung der Leitf¨ahigkeit im mechanisch belasteten Bereich der DNS bleibt der Ionenstrom jedoch identisch. Somit kann er bei einer Relativmessung wegnormiert werden.

Nat¨urlich kann mit diesem Ansatz nicht der Leitwert oder der spezifische Widerstand eines einzelnen DNS-Molek¨uls bestimmt werden, aber eine grunds¨atzliche Beantwortung der Frage, ob oder unter welchen Voraussetzungen DNS elektrische Leitf¨ahigkeit zeigt, ist mit diesem Vorgehen besser begr¨undbar.

3.2 Voraussetzungen

Um das Experiment wie oben entworfen durchf¨uhren zu k¨onnen, m¨ussen folgende Vorausset- zungen erf¨ullt sein:

• Das Strecken der DNS auf verschiedene Dehnungsl¨angen muss kontrolliert durchgef¨uhrt werden. Abgesehen von den Dehn-Experimenten mit der AFM-Spitze, bei denen die DNS beliebig zwischen den Dehnungsfaktoren 1,0 bis 1,6 ausgemessen wurde, ist die Deposition auf einem Substrat bisher nur ungedehnt (Faktor 1,0; relaxierte Konturl¨an- ge) oder vollkommen ¨uberstreckt (Faktor 1,6) gelungen [3,4]. Der Grund hierf¨ur ist das flache Kraftplateau, welches nicht viel Spielraum f¨ur die Einstellung der Ziehparameter l¨asst. Dennoch soll in den Experimenten dieser Arbeit der Streckfaktor im Fl¨ussigkeits- meniskus durch Variation des Salzgehaltes der DNS-L¨osung und der Verdampfungs- so- wie Abflussgeschwindigkeit auf dem jeweiligen Substrat kontrolliert werden. Eine weitere Kontrolle des Dehnungsparameters kann durch eine geeignete Oberfl¨achenbeschaffenheit des Substrates (glatt oder rau beziehungsweise hydrophil oder hydrophob) erreicht wer- den.

• DNS in verschiedenen Dehnungszust¨anden muss an geeignete Leiterstrukturen angehef- tet werden. Die hier benutzte, ungedehnte DNS besitzt eine L¨ange von knapp 16µm, vollkommen ¨uberdehnt ist sie somit etwa 25µm lang. Es wurden mit lithographischen Methoden 1µm dicke Leiterbahnen aus Gold strukturiert, deren Abst¨ande 15µm, 18µm, 21µm und 24µm betragen. Bei Anheftung von DNS zwischen diesen Strukturen ist so- mit der Streckfaktor in festen Abstufungen fest vorgegeben. Gold bietet sich aufgrund seiner guten elektrischen Leitf¨ahigkeit, seiner weitgehend chemischen Inertheit, aber der M¨oglichkeit, mit Thiolgruppen (HS-Bindungen) modifizierte Biomolek¨ule an sich zu binden, hierzu hervorragend an.

• Zur Beobachtung und Kontrolle der DNS-Strukturen m¨ussen diese Molek¨ule unter dem Mikroskop sichtbar gemacht werden. Da DNS einen ¨ahnlichen Brechungsindex wie Was- ser besitzt und selbst kaum einen Kontrast liefert, k¨onnen R¨uckstreuexperimente und

3.3 Lithographische Probenherstellung

Standardmikroskopie nicht eingesetzt werden. Das DNS-Molek¨ul wird deshalb zur De- tektion mit einem Fluoreszenz-Farbstoff eingef¨arbt und unter dem Fluoreszenzmikro- skop beobachtet. Der Farbstoff mit dem Namen

”YOYO“ fluoresziert gr¨un bei Einstrah- lung von blauem Licht. Die YOYO-Molek¨ule werden in den DNS-Strang eingelagert, gehen dabei aber keine chemische Bindung ein. Sie liegen in der Mitte der Doppelhelix zwischen den Basenpaaren in der Konzentration von zirka einem Farbstoffmolek¨ul auf f¨unf Basenpaare vor. Diese Farbstoff-Einlagerungen ver¨andern das DNS-Molek¨ul nicht in seinen Bindungs- und Streckeigenschaften, dennoch quillt das Molek¨ul ein wenig auf.

F¨ur pr¨azise Leitf¨ahigkeitsmessungen muss daher dieser Kontrollfarbstoff nach dem Test auf eine gelungene Anbindung an das Goldsubstrat wieder ausgewaschen werden.

• Neben der Herstellung richtig dimensionierter Proben sowie der Kontrolle der Anheftung und Streckung der DNS ist ein Setup zur Strommessung durch die DNS erforderlich.

Hierbei m¨ussen kleine Spannungen pr¨azise und m¨oglichst kontrolliert an das zu unter- suchende Molek¨ul angelegt werden, ohne die Probe zu zerst¨oren und m¨oglichst unter Ausschluss von Verf¨alschungen durch Kontaktspannungen. Bei diesem Schritt muss wie- der der mesoskopische Charakter der zu untersuchenden Strukturen beachtet werden.

3.3 Lithographische Probenherstellung

Ein großer Teil dieser Diplomarbeit wurde auf die Herstellung lithographischer Goldstrukturen zur Anheftung der DNS verwandt. Als Substrat kamen zwei Materialien zum Einsatz:

1. Glas in Form von Deckgl¨aschen zur Mikroskopie.

Dabei handelt es sich um Deckgl¨aser der Firma Menzel mit 24 mm mal 24 mm Kanten- l¨ange und 170µm Dicke. Sie bestehen aus einem Borsilikatglas (Kennung: D 263), das eine sehr hohe chemische Best¨andigkeit garantieren soll. Es wird ohne Verunreinigung geliefert; Versuche, zus¨atzlich eigene Reinigungsverfahren (z. B. Aceton, Ultraschall- bad, Isopropanol) einzusetzen, lieferten nur schlechtere Ergebnisse. Geringe Mengen an Glasstaub identischer Zusammensetzung wie das Glas der Deckgl¨aser, der das Zusam- menkleben einzelner Glaspl¨attchen w¨ahrend des Transports verhindert, kann komplett mit Stickstoff abgeblasen werden. Ein Vorteil von Glas als Substrat ist die M¨oglich- keit, sowohl f¨ur Auflicht- als auch f¨ur Durchlichtmikroskopie einfach einsetzbar zu sein.

Deckgl¨aser dieser Art werden in allen g¨angigen Mikroskopen (auch mit einem Immersi- onsobjektiv mit sehr kurzer Brennweite) verwendet.

2. Oxidierte Siliziumwafer (mit Siliziumnitrit-Schicht).

Silizium ist ein standardisiertes Substrat f¨ur lithographische Verfahren. In dieser Arbeit wurden oxidierte Wafer (mit einer Siliziumnitritschicht an der Oberfl¨ache) eingesetzt, da das Substrat an sich elektrisch isolierend sein muss. Das Material wurde ebenfalls auf eine quadratische Form von 24 mm mal 24 mm zurechtgeschnitten, um es im gleichen Verfahren wie die Glassubstrate bearbeiten zu k¨onnen. Nach dem Schneiden wurden die Si-Wafer ebenfalls durch Abblasen mit Stickstoff vom Schneidestaub gereinigt. Zwar ist Silizium f¨ur lithographische Verfahren besser geeignet als Glas (obwohl oxidiertes Si auf der Oberfl¨ache chemisch identisch zu SiO2-Glas ist), aber mit einem Si-Substrat ist nur Auflichtmikroskopie durchf¨uhrbar.

Die Goldstrukturen auf beiden Substraten werden jeweils in zwei Lithographieschritten pro- duziert: Optische Lithographie zur Herstellung der

”groben“ Strukturen im Millimeterbereich bis zur Gr¨oßenordnung von 100µm und Elektronenstrahllithographie f¨ur die Feinstruktur bis zu einer Gr¨oße von 1µm.

3.3.1 Optische Lithographie Die Herstellung der

”Grobstrukturen“ mittels optischer Lithographie gliedert sich in sechs Schritte:

1. Proben belacken und ausbacken 2. Belichtung mit UV-Licht

3. Entwicklung der belichteten Strukturen 4. Bedampfung mit Gold

5. Lift-Off mit Aceton

6. Kontrolle unter dem Mikroskop

Die Schritte eins bis drei m¨ussen im Dunkeln beziehungsweise im schwachen Gelblicht durchgef¨uhrt werden.

Zun¨achst wurden die Glas- beziehungsweise Siliziumproben gr¨undlich mit Stickstoff ab- geblasen und anschließend bis zur Bedampfung nur in der Flowbox weiterbehandelt. Eine Flowbox wird von innen stets mit gefilterter, sauberer Luft durchsp¨ult, so dass kein Staub von außen nach innen gelangen kann. Zum Abdampfen einer eventuell auf dem Substrat vor- handenen Wasserschicht und zur weiteren Vermeidung von Kondenswasser wurden die Proben auf einer Heizplatte mit einer Temperatur von 100^◦C vor der Belackung aufbewahrt.

Im ersten Schritt wird der Fotolack aufgetragen. Es wurde optischer Lack der Firma Micro Resist Technologie(Positiv Photoresist ma-P 205) verwendet, der empfindlich auf UV-Licht ist. Auf einer Lackschleuder wurde der Lack mit einer Dicke von etwa 600 nm fol- gendermaßen aufgebracht: Das Substrat wurde mit Hilfe einer Spritze vollst¨andig mit dem d¨unnfl¨ussigen Lack bedeckt. Danach wurde es sofort auf 3000 Umdrehungen pro Minute be- schleunigt mit einer Schleuderzeit von 60 Sekunden. Die vollst¨andige Bedeckung mit Lack und eine fehlende langsame Rotationszeit zu Beginn des Schleuderprozesses zur Verteilung des Lacks liegt in der rechteckigen Probenstruktur begr¨undet. Der Fotolack trocknet sehr schnell ein, so bringt eine nur teilweise Bedeckung der Probe und ein vorgeschalteter langsamer Ver- teilprozess auf der Lackschleuder, wie er laut Datenblatt vorgesehen ist, unbefriedigende Er- gebnisse. Beim gem¨aßigten Schleudern bleiben die Tropfen in den Ecken der Rechteckstruktur h¨angen und trocknen zu dicken Klumpen zusammen, die auf die innere Fl¨ache der Substrate hineinragen. Mit dem auf unseren Fall optimierten Prozess konnte dies verhindert werden.

Der Lack besteht aus langen Kohlenstoffketten, die durch f¨unfzehnmin¨utiges Ausbacken im Umluftofen bei 100^◦C quervernetzen. Nach diesem Schritt wurden die Substrate in Wafer- dosen gelagert und durch Einwickeln in Aluminiumfolie vor Lichteinstrahlung gesch¨utzt. Die Proben blieben somit in diesem Stadium ¨uber einige Zeit haltbar.

F¨ur die Belichtung wurde eine optische Maske entworfen (Abb. 3.1 und 3.2). Sie wur- de mit dem Computerprogramm AutoCAD generiert und im Fotolabor der Universit¨at auf

3.3 Lithographische Probenherstellung

Abb. 3.1: Gesamtansicht der Maske f¨ur die optische Lithographie:

Die Ansicht zeigt die grobe ¨auße- re Struktur f¨ur die Goldzuleitun- gen. Die Kantenl¨angen der Pads außen betragen 2 mm, die rechten und linken Pads f¨uhren jeweils zu der gleichen Feinstruktur. Die in- neren Linien haben eine Breite von 100µm.

einen Schwarzweiß-Kleinbildfilm ¨ubertragen. Sie enth¨alt die Strukturen f¨ur die ¨außeren, gro- ben Goldzuleitungen mit den makroskopischen Kontakten. Die rechts und links jeweils f¨unf Kontaktpads haben eine Kantenl¨ange von je 2 mm, die inneren Zuleitungen enden bei einer Breite von 100µm. Die außen liegenden Pads sollen sp¨ater im Experiment an die Spannungs- quelle angeschlossen werden. Im Inneren der Struktur sind kleine Marker angebracht, die eine Linienbreite von 50µm besitzen. Sie werden ben¨otigt, um das Schreibfeld des Elektronenmi- kroskops bei der anschließenden Elektronenstrahllithographie pr¨azise ¨uber der fixierten Probe ausrichten zu k¨onnen. Ideen f¨ur das prinzipielle Maskendesign stammen aus [29].

Substrat und Maske wurden in einem eigens konstruierten Belichtungshalter eingespannt (Abb.3.3). Er enth¨alt ein in schwarzes PVC eingelassenes 24 mm mal 24 mm großes Bankett von 200µm Tiefe sowie eine 35 mm breite F¨uhrungsschiene f¨ur die Filmmaske. Die so exakt uber dem Substrat justierbare Maske wird mit einer Edelstahlklappe fest aufgedr¨¨ uckt, um W¨olbungen im Filmmaterial zu verhindern. Durch ein ebenfalls 24 mm mal 24 mm großes Belichtungsfenster in der Edelstahlklappe erfolgt die Lichteinstrahlung bei der Belichtung.

Zur Belichtung wurde eine UV-Lampe mit der Wellenl¨ange λ= 365 nm und einer Leistung von 4 Watt verwendet. Der Abstand von Probenhalter und Lichtquelle betrug ungef¨ahr 20 cm.

Da der weiße, durchl¨assige Teil der Filmmaske dennoch einen sehr hohen UV-Anteil ab- sorbiert, wurde die Belichtung nach anf¨anglichen Versuchen mit einer Belichtungszeit gem¨aß Datenblatt von 35 Sekunden auf zehn Minuten optimiert. Durch die feste Fixierung gab es dabei keine durch das Setup bedingten Unsch¨arfen.

Abb. 3.2: Innenansicht der Maske f¨ur die op- tische Lithographie:

Der Zoom in den inneren Teil zeigt die Marker mit einer Linienbreite von 50µm f¨ur die Justierung des Schreibfeldes bei der Elektronen- strahllithographie.

Abb. 3.3: Halter f¨ur den optischen Belich- tungsprozess:

Der Probenhalter besteht aus ei- ner schwarzen PVC-Unterlage, um Lichtreflexionen bei der Belichtung zu vermeiden. Die Unterlage be- sitzt eine eingelassene, rechteckige Vertiefung f¨ur die Probe und einer F¨uhrungsschiene f¨ur die Fotomas- ke. Der Deckel besteht aus Edel- stahl, um Maske und Probe fest zu fixieren.

An den belichteten Stellen ist die Vernetzung des Fotolacks aufgebrochen und dieser somit l¨oslich f¨ur den Entwickler. Als Entwickler kam das L¨osungsmittel ma-D 330 ebenfalls der Firma Micro Resist Technologie unverd¨unnt zum Einsatz. Die Entwicklung erfolgte durch Einstellen der Probe ¨uber 90 s im Entwicklerbad mit leichtem kurzen Schwenken nach der H¨alfte der Entwicklungszeit. Nach 45 Sekunden im Entwickler war der Lack schon gel¨ost, befand sich aber noch auf dem Substrat und wurde durch das Schwenken ganz abgeschwemmt.

Anschließend wurde der Entwicklungsprozess durch 60-sek¨undiges vorsichtiges Schwenken der Proben in Millipore-Wasser gestoppt. Millipore-Wasser ist sehr reines, vollkommen ionenfreies Wasser. Es verdunstet r¨uckstandsfrei, somit k¨onnen die Strukturen an Luft in der Flowbox getrocknet werden, ohne das Risiko einer Zerst¨orung des Lackprofils durch Zerfließen im Ofen (oberhalb der Glastemperatur von zirka 80^◦C) oder durch Abplatzen im Stickstoffgebl¨ase einzugehen.

Nach diesem Schritt erfolgte eine Zwischenkontrolle im Lichtmikroskop. Zur weiteren Ver- wendung muss die Probe nicht weiter im Dunkeln beziehungsweise unter Gelblicht gehandhabt werden.

Im vierten Schritt wurden die Proben in eine Hochvakuum-Verdampfungs-Anlage einge- baut. Der hierzu konstruierte Halter besteht aus einer runden Edelstahlplatte mit wiederum dem gleichen 24 mm mal 24 mm großen und 200µm tiefen Einlass. Das Substrat wurde mit kleinen Federklammern aus Edelstahl am Rand festgehalten, um sie ¨uber Kopf in die Anlage einzuspannen. Die Aufdampfanlage ist ein Fabrikat der Firma Leybold-Heraeusaus dem Jahre 1978 (PD 1000 AZw). Sie wurde f¨ur diese Arbeit wieder general¨uberholt. Die Anlage besteht nun aus einem Komplettpumpstand mit einer Drehschieberpumpe als Vor- und einer Oldiffusionspumpe als Hauptpumpe sowie einer 60 l Rezipientenglocke aus Glas, zwei getrennt¨ ansteuerbaren, wassergek¨uhlten Aufdampfschiffchen aus Wolfram, einem Probenshutter und einem wassergek¨uhlten Schwingquarz zur Schichtdickenmessung. Der erreichbare Enddruck lag nach der Instandsetzung bei 1–2·10⁻⁶mbar.

Auf das Substrat wurden 5 nm Chrom als Haftvermittler und anschließend 50 nm Gold bei Raten von 1 ˚A/s beziehungsweise 5 ˚A/s aufgedampft, ohne das Vakuum zwischen beiden Aufdampfprozessen zu unterbrechen. Der hierf¨ur ben¨otigte Strom f¨ur die Wolframschiffchen BD 482000–T der FirmaUnaxisbetrug etwa 20 Amp`ere.

Als letzter Schritt zur Herstellung der Grobstrukturen wird der Lift-Off durchgef¨uhrt. Das komplett bedampfte Substrat wird in Aceton gelegt und leicht erw¨armt. Aceton l¨ost den Foto- lack auf dem gesamten Substrat unspezifisch ab. Es greift den Lack von den Substratr¨andern

3.3 Lithographische Probenherstellung

her an, um so zwischen das Glas und die Metallschicht zu gelangen. An den Stellen, an denen im Entwicklungsschritt nach der Belichtung bereits selektiv der Lack entfernt wurde, befindet sich die Chrom-Gold-Schicht direkt auf dem Substrat und bleibt unber¨uhrt durch das Aceton haften. An den ¨ubrigen Stellen l¨ost sich der Lack und schwemmt das dar¨uberliegende Gold mit ab. Um Acetonflecken (weiße Schlieren) zu vermeiden, wurde in einer Glasschale mehr und mehr Isopropanol zugegeben und durch wiederholtes Abgießen das Aceton schließlich v¨ollig ersetzt. Isopropanol (IPA) verdampft schnell und r¨uckstandsfrei. Es wurde im leichten Stickstoff-Fluss abgeblasen. Hiernach wurde die Probe wiederum einer optischen Kontrolle im Lichtmikroskop unterzogen.

3.3.2 Verbesserungen bei der optischen Lithographie

Das im vorigen Abschnitt beschriebene Verfahren funktioniert gut und problemlos mit Sub- straten aus reinem Silizium (auf denen Teststrukturen gefertigt wurden) und oxidiertem Sili- zium. Auf den Glassubstraten ergab sich ein Problem. Die Kontrolle der lithographisch gefer- tigten Lackstrukturen nach Schritt 3 ergab ein positives Ergebnis. Allerdings erwies sich der Lift-Off nach der Bedampfung als schwierig und nicht reproduzierbar. Entweder l¨oste sich die gesamte, aufgedampfte Chrom-Gold-Schicht vom ganzen Substrat ab oder sie blieb wie in den meisten F¨allen komplett haften. Auch ein Acetonbad von bis zu 24 Stunden und mehrmaliges Erhitzen brachte keine Verbesserung. Nach einem Acetonbad von mehreren Stunden ließ sich die Metallschicht ¨uber dem Fotolack allerdings mit einem kurzen Ultraschallbad von wenigen Sekunden bei geringer Intensit¨at abl¨osen. Die zur¨uckbleibende Struktur erschien auf den ers- ten Blick gelungen, aber eine intensive Kontrolle unter dem Licht- und Elektronenmikroskop zeigte, dass die Kernstrukturen zwar vorhanden waren aber besch¨adigt wurden (Abb.3.4,3.5 und 3.6). Durch weitere Optimierung der Belackungs-, Belichtungs-, Bedampfungs- und Lift- Off-Parameter ließ sich dieses Problem nicht l¨osen.

Um dennoch ein f¨ur Durchlichtmikroskopie geeignetes Glassubstrat zu verwenden, wurde schließlich der Herstellungsprozess mit folgender Modifizierung durchgef¨uhrt: Zwischen Glas und Fotolack wurde eine d¨unne Schicht Polyimid eingebracht. Polyimid ist fast klar mit einer gelblichen F¨arbung ¨ahnlich der von fl¨ussigem Eiweiß. Somit ist eine Durchlichtmikroskopie noch m¨oglich, da nur wenig Licht absorbiert wird. Hartes Polyimid wird durch Ausbacken des z¨ahfl¨ussigen Polyamids erhalten. Das Aufbringen der Zwischenschicht erfolgte vor dem Aufspinnen des Fotolacks mit folgenden Parametern: Ein Tropfen Polyamid wurde mit einem sauberen Zahnstocher komplett auf dem ges¨auberten Substrat verteilt. Um eine glatte und gleichm¨aßige Oberfl¨ache der Polyamidschicht zu erhalten, wurde drei Sekunden bei 300 Um-

Abb. 3.4: ¨Ubersicht ¨uber eine defekte Grob- struktur ohne Polyimidschicht:

Risse und Fehler in der Struktur sind schon bei der ersten Kontrol- le nach dem Entwickeln sichtbar.

Der Lack hat sich an den belich- teten Stellen nicht vollst¨andig vom Glas gel¨ost.

Abb. 3.5: Defekte Grobstruktur an einer Ver- j¨ungungsstelle:

Nahaufnahme einer Zuleitung an einer Verj¨ungungsstelle. Der be- lichtete Fotolack ist trotz sorgf¨al- tiger Entwicklung nur teilweise ab- gel¨ost. Die R¨ander sind abgeplatzt und haben keine senkrechten Kan- ten. Die Risse sind in der glei- chen Gr¨oßenordnung wie die inne- ren Strukturen.

Abb. 3.6: Zoom in eine defekte Grobstruk- tur:

Zu sehen ist eine innere Zuleitung mit einer Breite von 100µm. ¨Uber eine Breite von etwa 50µm sind nur Ans¨atze einer Entwicklung er- kennbar.

drehungen pro Minute auf der Drehschleuder gedreht und anschließend f¨ur 90 Sekunden auf 5000 Umdrehungen pro Minute beschleunigt. Damit erh¨alt man eine f¨ur Polyamid d¨unnstm¨og- liche Schicht von 2µm. Unmittelbar nach dem Schleudervorgang erfolgte ein kurzes Vorbacken von 60 Sekunden auf der Heizplatte bei einer Temperatur von 160^◦C bevor die Probe zum endg¨ultigen Ausbacken f¨ur 30 Minuten bei 250^◦C im Umluftofen behandelt wurde. Durch Ausdampfen des L¨osungsmittels beim Backen und Quervernetzungen ensteht aus Polyamid das feste Polyimid. Die vollst¨andige Umwandlung in Polyimid erfolgt erst bei Temperaturen oberhalb von 300^◦C im Vakuum. Danach ist Polyimid zus¨atzlich tieftemperaturbest¨andig.

Das hier vorgestellte Verfahren ist jedoch f¨ur die in dieser Arbeit vorgestellten lithographi- schen Verfahren vollkommen ausreichend.

Nach Abk¨uhlung der Probe auf 100^◦C erfolgte dann die weitere Pr¨aparation mit gleichen Parametern wie in Abschnitt 3.3.1 beschrieben. Da Gold auf Polyimid ohne Haftvermittler aufdampfbar ist, wurde bei diesen Proben die Chromschicht bei der Bedampfung weggelassen.

Auf Polyimid ist der Lift-Off problemlos durchf¨uhrbar. Nach einem Acetonbad von wenigen Minuten und kurzer Erw¨armung l¨asst sich das ¨ubersch¨ussige Gold im Acetonfluss absp¨ulen, ohne die ¨ubrigen Strukturen anzugreifen.

3.3.3 Elektronenstrahllithographie

Nach der Herstellung der Grobstrukturen wurden in das Innere der Substrate die Fein- strukturen geschrieben. Das innere freie Feld auf den Proben hat eine Gr¨oße von 1 mm mal 1 mm, die dort ben¨otigten Strukturen m¨ussen an die 100µm breiten Enden der Grobstruktur anschließen und werden im Inneren zu Linienbreiten von 1µm verj¨ungt (Abb.3.7). Strukturen

3.3 Lithographische Probenherstellung

Abb. 3.7: Schreibvorlage f¨ur die Elektronen- strahllithographie:

In rot sind die 100µm-Pads der Grobstruktur skizziert, auf diese kommen die Anschluss-Pads der Feinstruktur zu liegen. In gr¨un ist das Schreibfeld des REM einge- zeichnet, die schwarzen Linien stel- len die 1µm breiten Zuleitungen dar, die in der Mitte unterschied- liche Abst¨ande haben. Die Skizze ist nicht maßstabsgetreu.

dieser Art lassen sich gut mit Hilfe der Elektronenstrahllithographie erzeugen. Das prinzipielle Vorgehen ist dem der optischen Lithographie ¨ahnlich.

Zun¨achst wird eine elektronenempfindliche Lackschicht aufgebracht, welche sich aus zwei Lagen zusammensetzt. Die untere, bestehend aus dem Co-Polymer

”MMA-MAA“ (Methyl- methacrylat-Methacryls¨aure), ist empfindlicher bei Einstrahlung von Elektronen als die obere Schicht aus PMMA (Polymethylmethacrylat,

”Plexiglas“). Somit l¨asst sich beim Entwickeln ein Unterschnitt im Lackprofil erzeugen, der den Bedampf- und Lift-Off-Vorgang erleichtert.

Im Einzelnen wurden folgende Schritte durchgef¨uhrt: Die fertigen Proben aus der optischen Lithographie wurden zur S¨auberung wieder mit Stickstoff abgeblasen und in der Flowbox zur Vermeidung eines Wasserfilms auf der Heizplatte bei 100^◦C gehalten. Der Schleuderprozess ist aufwendiger als jener f¨ur den Fotolack. Zun¨achst wurde mit Spritze und aufgesetztem Filter das Co-Polymer auf die komplette Probe aufgetragen. Innerhalb von drei Sekunden wurde eine Rampe auf 400 Umdrehungen pro Minute gefahren; diese Geschwindigkeit wurde anschließend f¨ur 4,5 Sekunden gehalten, damit sich der Lack auf der Probe verteilt. Mit maxi- maler Beschleunigung wurden dann 2500 Umdrehungen pro Minute erreicht und f¨ur insgesamt 90 Sekunden geschleudert. Innerhalb von zwei Sekunden wurde dann der Schleudervorgang abgebremst und beendet. Dieser Prozess ergibt eine Schichtdicke von 560 nm. Das Co-Polymer wurde auf der Heizplatte f¨ur 60 Sekunden bei 100^◦C vorgeh¨artet, bevor die zweite Schicht aus PMMA aufgetragen wurde. Der Schleuderprozess f¨ur das PMMA war bis auf eine Dauer von 70 Sekunden bei 5000 Umdrehungen pro Minute identisch mit dem f¨ur das Co-Polymer. Die Schichtdicke des PMMA ergibt sich hierbei zu 160 nm. Anschließend erfolgte das Aush¨arten des Elektronenlacks f¨ur 30 Minten bei 170^◦C im Umluftofen.

Da die Substrate aus isolierenden Materialien bestehen, wird ¨uber den Elektronenlack eine f¨unf bis zehn Nanometer d¨unne Goldschicht aufgesputtert. Elektronen k¨onnen den darunter liegenden Lack belichten, aber auch ¨uber das Gold abfließen, um Aufladungseffekte zu ver- meiden. Die Struktur, die mit dem Rasterelektronenmikroskop (REM) geschrieben wurde, ist in Abbildung3.7skizziert. Die ¨außeren Pads mit einer Breite von etwa 30µm kommen auf die Enden der Grobzuleitungen zu liegen. Mit Hilfe der in Abbildung 3.2 gezeigten Marker ließ sich das Schreibfeld des REM pr¨azise genug ¨uber der Probe justieren. Die Justierun- genauigkeit im REM liegt bei wenigen µm, so dass die Justierung der Zuleitungen keinen kritischen Parameter darstellte. Die Linien der Feinstrukturen haben wie bereits beschrieben eine Dicke von 1µm und aufsteigende Abst¨ande von 15µm bis 24µm. Die Elektronenstrahl- lithographie an sich und der anschließende Lift-Off wurden von C´ecile Bacca und Vojko Kunej

in der Arbeitsgruppe Scheerdurchgef¨uhrt. N¨ahere Beschreibungen und weitere Parameter des Prozesses finden sich in [30].

3.4 Chemische Vorbereitung der DNS

Wie in Abschnitt 3.2 erw¨ahnt, erfolgt die Anbindung der DNS an eine Goldoberfl¨ache ¨uber eine Thiolgruppe, eine Schwefel-Wasserstoff-Gruppe (HS–) am Ende des Biomolek¨uls [31].

Das genaue Verfahren zur DNS-Pr¨aparation wurde in Zusammenarbeit mit Roman Lehner aus dem Lehrstuhl Maret entwickelt. Bevor die Anheftung erfolgen kann, muss daher eine Thiolmodifizierung der DNS durchgef¨uhrt werden. Das Thiol wird nicht direkt an die λ- DNS gebunden, sondern ¨uber ein sogenanntes

”Oligo“-Molek¨ul. Oligos sind kurze einstr¨angige DNS-Sequenzen mit einem Zucker-Phosphat-R¨uckgrat und einzelnen Basen, quasi eine l¨angs der Wasserstoff-Br¨ucken aufgetrennte Doppelhelix (Abb. 3.8). An einem Ende eines solchen Oligos h¨angt die HS-Gruppe, zur anderen Seite wurden in dieser Arbeit Oligos mit 12 Basen verwendet (Oligo A der FirmaMWG Biotech AG; 5’–GGG-CGG–CGA–CTT–3’ mit HS am 3’-Ende).

Abb. 3.8: Struktur eines Oligo-Molek¨uls:

Dargestellt sind die 12 freien DNS- Basen am rechten und die Thiol- gruppe am linken Ende.

Die verwendete λ-DNS der Firma Fermentas stammt von einem Bakterium und liegt in einer ringf¨ormigen Ausgangskonformation vor; sie muss zun¨achst linearisiert werden. Die Pr¨aparation im Einzelnen gliedert sich in folgende noch zu erl¨auternde Schritte:

1. Phosphorylisierung der Oligos

2. Aufspaltung des DNS-Ringes und Linearisierung 3. Pufferung des DNS-Oligo-Gemischs

4. Ligation der Oligos an die DNS 5. Reinigung der DNS-Stamml¨osung 6. Markierung mit Fluoreszenzfarbstoff 7. Zugabe eines Anti-Bleichmittels

Die Schritte eins bis f¨unf wurden unmittelbar hintereinander durchgef¨uhrt, die beiden an- schließenden Schritte erst kurz vor dem Experiment.

Im ersten Schritt wird 1µl Oligo A-L¨osung der Konzentration 17 pmol/µl (Molmasse:

3920 g/mol) mit 1µl Ligasepuffer (T4-Ligasepuffer, FirmaBoehringerMannheim 1243-292, 10fach mit 20 mM ATP zugesetzt; zur Konstanthaltung des pH-Wertes), 7µl Millipore-Wasser sowie 1µl T4-Polynukleotidkinase vermischt und f¨ur 30 Minuten bei 37^◦C im Thermoblock inkubieren gelassen. Die Mischung erfolgt per Mikropipette in einem sterilen Epi-Gef¨aß. Die T4-Polynukleotidkinase liefert ein Phosphatmolek¨ul, welches sich am R¨uckgrat der Oligos an das 5’-Ende des letzten Zuckermolek¨uls heftet (Abb.3.9).

3.4 Chemische Vorbereitung der DNS

Abb. 3.9: Phosphorylisiertes Oligo-Molek¨ul:

Am freien Ende des R¨uckgrates ist ein Phosphat-Molek¨ul angelagert (P steht f¨ur das gesamte Phosphat- Molek¨ul).

Die gewonnenen 10µl L¨osung enthalten einen 1000fachen ¨Uberschuss von Oligos bez¨ug- lich DNS in den folgenden Reaktionen, um dort das Reaktionsgleichgewicht zu Gunsten des gew¨unschten Verh¨altnisses zu verschieben.

Im zweiten Schritt wird 1µl dieser phosphorylisierten Oligol¨osung mit 10µl Millipore- Wasser verd¨unnt und mit 33µl λ-DNS (c= 0,3 mg/ml) versetzt. Die zugegebene λ-DNS ist ringf¨ormig wie in Abbildung 3.10skizziert.

Abb. 3.10: Ringf¨ormigeλ-DNS:

Im R¨uckgrat der DNS sind ¨uber 12 Basenpaare versetzt zwei Pho- phatl¨ucken vorhanden, an denen der DNS-Ring aufbricht. Das Bild ist nicht maßst¨ablich, die DNS enth¨alt in ihrem Ring 48503 Ba- senpaare.

Ihr Umfang betr¨agt knapp 16µm. Am inneren und ¨außeren R¨uckgrat befindet sich jeweils eine L¨ucke aufgrund eines fehlenden Phosphatmolek¨uls, die genau um 12 Basenpaare versetzt sind. Bei Erw¨armung der Probe auf 70^◦C f¨ur 10 Minuten im Thermoblock bricht die DNS an diesen Phosphatl¨ucken auf, die Wasserstoff-Br¨ucken der dazwischen liegenden Basenpaare trennen sich und die DNS wird linearisiert (Abb. 3.11). Um eine weitere Denaturierung zu vermeiden, wird dieser Schritt mit einer Schockabk¨uhlung auf Eis beendet.

Dieλ-DNS hat nun an beiden Enden einen ¨Uberhang von 12 einzelnen Basen, einer davon hat genau die gespiegelte ( ˆ= umgekehrte Reihenfolge) und komplement¨are Abfolge zum hier

Abb. 3.11: Linearisierte λ-DNS:

Beide Enden des DNS-Molek¨uls haben ein Einzelstrang-Ende be- stehend aus 12 Basenpaaren.

Abb. 3.12: Angelagertes Oligo an DNS:

Die Phosphorylisierung des DNS- Stranges ist fast abgeschlossen.

Die H-Br¨ucken zwischen Partner- basen sind bereits aufgebaut, es fehlt noch die Phosphat-Zucker- Bindung im R¨uckgrat.

verwendeten Oligo A-Molek¨ul. Dementsprechend ist die Abfolge am anderen Ende identisch, aber gespiegelt zu Oligo A und k¨onnte in einem identischen Pr¨aparationsprozess mit dem zu Oligo A komplement¨aren Oligo B thiolmodifiziert werden.

Nach der Abk¨uhlung wird nochmal 5µl T4-Ligase-Puffer hinzugef¨ugt und eine Stunde bei 50^◦C einwirken gelassen. Der Puffer stabilisiert die L¨osung. Die Oligo-Molek¨ule lagern sich an das entsprechende komplement¨are Ende der DNS an und bilden bereits die Wasserstoff- Br¨ucken aus. An der Stelle des R¨uckgrats muss aber noch die Phosphat-Zucker-Bindung vom phosphorylisierten Oligo zur λ-DNS aufgebaut werden (Abb.3.12).

Im vierten Schritt wird 1µl T4-DNS-Ligase (Firma Boehringer Mannheim, 481-220) hinzugegeben und ¨uber bis zu 12 Stunden inkubieren gelassen. In diesem Schritt wird die Phosphatl¨ucke vollst¨andig geschlossen (Abb.3.13).

Abb. 3.13: Vollst¨andig an DNS gebundenes Oligo:

Die T4-DNS-Ligase katalysiert die voll- st¨andige Bindung des Oligo-Molek¨uls an die DNS.

Aufgrund des 1000fachen ¨Uberschusses sollte die Ligation aller λ-DNS-Molek¨ule erfolgt sein, die ¨ubersch¨ussigen thiolhaltigen Oligos m¨ussen entfernt werden. Dies geschieht im f¨unf- ten Schritt mit einer NICK-R¨ohre, in der die L¨osung mit Puffer durch ein Gelbad gefiltert wird. Die so gereinigte DNS-Stamml¨osung hat nun eine Konzentration vonc= 80 nmol/l oder 25 ng/µl. Sie kann im K¨uhlschrank ¨uber l¨angere Zeit aufbewahrt werden.

Vor der Durchf¨uhrung des Experiments unter dem Mikroskop wird im sechsten Schritt der Fluoreszenzfarbstoff eingelagert. Von der DNS-Stamml¨osung werden 5µl mit 42µl TBE- Puffer und 2µl des Farbstoffes YOYO (c = 0,02 mmol/l) vermischt und ¨uber zwei Stunden einwirken gelassen. Dies ergibt ein Verh¨altnis von einem YOYO-Molek¨ul zu f¨unf Basenpaaren.

Da der Farbstoff bei Belichtung mit blauem Licht schnell ausbleicht, wird im letzten Schritt unter dem Abzug 1µl 2-Mercapto-Ethanol (C2H6OS) hinzupipetiert. Dieser Stoff wirkt als Anti-Bleichmittel und l¨asst ein l¨angeres Mikroskopieren zu. Nach diesem Schritt betr¨agt die Konzentration der DNS in der L¨osung noch 5 ng/µl.

3.5 Anheftung von DNS an ein Substrat

Uber die gebundene Thiolgruppe kann der DNS-Strang nun an eine Goldoberfl¨¨ ache angehef- tet werden. Dabei bleibt das offene Ende noch frei und beweglich, erst beim (teilweisen) Ein- beziehungsweise Antrocknen klebt die DNS an allen Stellen auf Gold. Bei der endg¨ultigen Pr¨a- paration m¨ussen daher vor dem Ankleben die richtige Lage der DNS und der Streckparameter festliegen.

3.6 Streckung der DNS

Die mit YOYO und Anti-Bleicher versetzte DNS-L¨osung wird nochmals mit TBE 1:1 ver- d¨unnt, so dass die Konzentration der DNS bei der Anheftung bei 2,5 ng/µl liegt. Ein Tropfen von 20µl dieser L¨osung wird auf das zu untersuchende Goldsubstrat gebracht. Um eine zu schnelle Eintrocknung w¨ahrend der Anbindungsphase zu verhindern, liegt das Substrat in ei- nem abgeschlossenen, sauberen Plastikbeh¨alter auf einem Parafilm. Parafilm ist ein luft-, aber nicht wasserdurchl¨assiger synthetischer Film mit einer Dehnbarkeit bis zu 200%. Unter dem Parafilm befindet sich ein mit Millipore-Wasser durchsetztes Fasertuch, um die Feuchtigkeit im Plastikbeh¨alter hoch zu halten. So l¨asst sich der DNS-Tropfen ¨uber Stunden hinweg ohne zu verdunsten auf dem Substrat halten und die Thiolgruppen k¨onnen an das Gold binden.

Nach einer Einwirkzeit von mindestens zwei Stunden wird der Tropfen vorsichtig durch mehrmaliges Sp¨ulen mit Pufferl¨osung und Absaugen mit der Mikropipette abgesp¨ult, bis nur noch ein kleiner Fl¨ussigkeitsfilm zur¨uckbleibt. Dieser Sp¨ulvorgang soll ungebundene DNS- Str¨ange entfernen, die beim Mikroskopiervorgang st¨oren. Danach kann das Substrat mit einem Deckgl¨aschen abgedeckt und unter dem Mikroskop untersucht werden.

3.6 Streckung der DNS

Zum Strecken der DNS werden in dieser Arbeit zwei verschiedene Varianten beschrieben. Zum einen die Streckung im elektrischen Feld und zum anderen im Meniskus eines Fl¨ussigkeits- tropfen.

Zur Streckung im elektrischen Feld wurde ein Probenhalter f¨ur das Mikroskop entworfen, in dessen Fokusebene auf allen vier Seiten kleine, senkrecht zur Ebene stehende Kondensa- torplatten aus Edelstahl eingelassen wurden. Durch Anlegen eines Potenzials zwischen jeweils

Abb. 3.14: Setup zum Strecken von DNS im Fl¨ussigkeitsmeniskus:

Im oberen Bildteil ist das Sub- strat bei der wiederholten Auf- und Abbewegung in der Pufferl¨o- sung zu sehen. Am Substratrand bildet sich der Meniskus aufgrund von Kapillarkr¨aften aus. Im un- teren Teil sind parallele und ge- streckte DNS-Str¨ange (gr¨un ein- gef¨arbt) abgebildet [16].

gegen¨uberliegenden Metallpl¨attchen l¨asst sich ein Feld ¨uber das Substrat aufbauen. Die be- n¨otigte Feldst¨arke f¨ur dieses Experiments betr¨agt 2 bis 6 V/cm.

Der zweite, auch in der Literatur weiter verbreitete Streckmechanismus geht ¨uber Dehnung der DNS im Fl¨ussigkeitsmeniskus. Ein prinzipieller Aufbau ist in Abbildung 3.14 skizziert.

Das Substrat wird in eine Pufferl¨osung getaucht und mit einer Geschwindigkeit von 30 bis 60µm/s mehrmals auf und ab bewegt. Zwei Varianten sind dabei denkbar. Einerseits kann DNS wie im vorigen Abschnitt beschrieben bereits an das Substrat angeheftet sein und wird im Meniskus der Pufferl¨osung beim Herausziehen nur ausgerichtet und gestreckt oder die L¨osung enth¨alt selbst noch das DNS-Extrakt, das sich bei diesem Vorgang anheften soll. Die zweite Variante hat den Nachteil, dass eine viel gr¨oßere Menge der DNS-L¨osung pr¨apariert werden muss und die Eigenschaften der Pufferl¨osung schlechter im Nachhinein noch durch Zugabe von Salz oder Verd¨unnung ver¨andert werden k¨onnen. Beim idealen Gelingen dieses Experiments erh¨alt man viele parallele, gestreckte DNS-Molk¨ule, wie in Abbildung3.14unten zu sehen.

3.7 Detektion

Die Detektion der gestreckten und fluoreszenzmarkierten DNS erfolgt im Mikroskop mit einem Oldispersionsobjektiv, um eine gr¨¨ oßere numerische Apertur und damit mehr Lichteinstrahlung zu erhalten.

Bei einem Glassubstrat wird erst mit weißem Durchlicht eine Justierung auf die Goldstruk- turen vorgenommen, bevor mit blauem Auflicht (weißes Halogenlicht gefiltert durch einen Blaufilter) eingestrahlt wird. Das r¨uckgestreute Licht wird durch einen Gr¨unfilter gelenkt, um im Dunkelfeld nur die gr¨unleuchtenden YOYO-Molek¨ule in den DNS-Str¨angen zu sehen.

Mit einem Silizium-Substrat erfolgt die Justierung bereits mit Auflicht im Dunkelfeld, aller- dings zun¨achst mit einem Rotfilter, um das vorzeitige Ausbleichen des Farbstoffes zu verhin- dern. Nach der Justierung wird auf den Blau-/Gr¨unfilter-Satz umgeschaltet. Beide Verfahren ergeben gr¨unleuchtende DNS-Strukturen wie in Abbildung3.14 unten zu sehen.

3.8 Leitf¨ ahigkeitsmessung

Nach erfolgter Streckung der DNS auf dem Substrat wird an den zwei Millimeter mal zwei Millimeter großen Außenpads der Goldstrukturen eine Spannungsquelle kontaktiert. ¨Uber eine”Source Measure Unit“ wird die Leitf¨ahigkeit mittels einer der ¨ublichen Schaltungen zur Strom-, Spannungs-, und Widerstandsmessung ermittelt [32].