Die TDP-43-Expression forciert den terminalen Abschnitt der Autophagie

Die Veränderungen im autophagischen Prozess wurden mit Hilfe unterschiedlicher experimenteller Ansätze überprüft. Der sogenannte GFP-Atg8-Prozessierungsassay ermöglicht es die Autophagierate unter verschiedenen Bedingungen und in mehreren Stämmen zu beobachten. Die Methode beruht auf der Messung von degradiertem GFP-Atg8 in der Vakuole. GFP-Atg8 ist ein Fusionsprotein, welches im Laufe des autophagischen Prozesses in die Phagophorenmembran verankert wird. Das geschlossene Vesikel oder Autophagosom wird in der Vakuole lysiert und das GFP-Atg8 zu GFP abgebaut. Das freie GFP-Signal gibt den Grad der Autophagie wieder und kann mittels Fluoreszenzmikroskopie bzw. Western Blot bestimmt werden (Abb. 22, 23; Shintani und Klionsky 2004). Für den GFP-Atg8-Assay wurde in einem Vorversuch der Wildtypstamm mit einem Kontroll- bzw.

TDP-43-codierenden Konstrukt (pCM190), sowie mit dem GFP-Atg8-Plasmid transformiert (siehe Abschnitt 3.7). Der Grad der Autophagie wurde unter nährstoffreichen Bedingungen (SMGalRD-Leu-Ura+Dox), nach ca. 16 Stunden Inkubation, fluoreszenzmikroskopisch ausgewertet (siehe Abschnitt 3.10). Die Zellen, welche das Kontrollplasmid oder das TDP-43-codierende Konstrukt enthielten, zeigten keinen signifikant optischen Unterschied in Bezug auf die vakuoläre GFP-Prozessierung. In beiden Gruppen konnten Zellen mit nur punktartigen Strukturen, ausschließlich vakuolärer Färbung oder mit beiden Merkmalen beobachtet werden (Abb. 22). Bei den punktuellen zytoplasmatischen Formen handelt es sich mit großer Wahrscheinlichkeit um Phagophoren oder Autophagosomen.

In einem weiteren Ansatz wurde neben dem wildtypischen Stamm auch der atg1-Deletionsstamm, in welchem die Autophagie blockiert ist, analysiert. Die Zellen wurden zunächst über Nacht in nährstoffreichem Medium (SMGalRD) inkubiert und anschließend in Hungermedium (SD-N) überführt (siehe Abschnitt 3.5.5). Die Kultivierung in nährstoffarmem Medium sollte die Autophagie forcieren. Die Auswertung der GFP-Abspaltung bei fortwährender TDP-43-Expression erfolgte mittels Western Blot (siehe Abschnitt 3.11 und 3.12). Während bei atg1 ausschließlich das Volllängenfusionsprotein nachgewiesen werden konnte, fand beim wt-Stamm eine GFP-Prozessierung statt (Abb. 23).

Freies GFP wurde sowohl unter Nicht-, als auch unter Hungerbedingungen nachgewiesen.

Die GFP-Freisetzung beim Kontrollplasmid, während der Inkubation in nährstoffreichem Medium, ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass über den Cvt-Weg (selektiver Weg der Autophagie) in geringem Umfang GFP-Atg8 zu GFP prozessiert wurde oder das sich die

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Flüssigmedium. Ein mikroskopischer Unterschied zwischen den Kontroll- oder TDP-43-enthaltenden Wildtypzellen war nicht existent. Bei beiden Populationen konnten Zellen mit nur punktartigen Strukturen (Bildreihe 3), ausschließlich vakuolärer Färbung (Bildreihe 2) oder mit beiden Merkmalen (Bildreihe 1) beobachtet werden. Maßstab: 5 µm.

Abb. 22: Schematische Darstellung und mikroskopische Auswertung des GFP-Atg8-Prozessierungsassays. (A) Während des autophagischen Prozesses werden überschüssige bzw. geschädigte Organellen und zytosolische Komponenten von der Phagophorenmembran umschlossen und in einem vollständigen Vesikel, dem Autophagosom, zur Vakuole transportiert.

Durch die posttranslationale Lipidierung von Atg8 mit Phosphatidylethanolamin (PE) wird das markierte Fusionsprotein GFP-Atg8 in die Lipiddoppelmembran verankert und gelangt so mit der vesikulären Fracht in die Vakuole. Dort wird es gespalten. (B) Die Prozessierung von GFP-Atg8 zu GFP war mikroskopisch auf Grund der vakuolären Grünfärbung erkennbar. Die Vakuole wurde zusätzlich mit CMAC visualisiert. Ferner konnten mittels Fluoreszenzmikroskopie Phago-phoren oder Autophagosomen durch zyto-plasmatische Punkte in den Zellen identifiziert werden. Die wildtypischen Kulturen enthielten neben dem GFP-Atg8-codierenden Konstrukt ein Doxycyclin-regulierbares Kontroll- oder TDP-43-codierendes Plasmid. Die Expressionsdauer betrug ca. 16 Stunden in SMGalRD

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(B)

(A)

Nährstoffbedingungen eine Prozessierung von GFP-Atg8 zu GFP. Dieser wurde mit einem * gekennzeichnet. Als Ladekontrolle diente die Hexokinase. (B) Quantifizierung des prozessierten GFP-Levels im wt wie in (A) beschrieben. Auf Grund der Expression von TDP-43 wurde vermehrt GFP-Atg8 zu GFP abgebaut. Diese Beobachtung war bei beiden Nährstoffbedingungen signifikant. Der Mittelwert berechnete sich aus fünf biologischen Klonen von drei unabhängigen Experimenten.

Zusätzlich angegeben wurde. Fehlerbalken: Standardfehler; Mann-Whitney Rank Sum Test: p-Werte:

*p<0,05, **p<0,01 und ***p<0,001.

Zellen bereits in einem frühstationären Stadium befanden und Autophagie zur Nährstoff- und Energiegewinnung nutzten. Mit Hilfe des Western Blots konnte zu beiden Zeitpunkten ein statistisch signifikanter Anstieg an prozessiertem GFP während der Expression von TDP-43 nachgewiesen werden (Abb. 23). Dies ist ein Hinweis darauf, dass TDP-43 den Grad der Autophagie steigert.

Zusätzlich zum Autophagieprozess erfolgte die Quantifizierung des GFP-Atg8-Proteinlevels (Abb. 24). Im nährstoffreichen Zustand konnte eine Anreicherung des Fusionsproteins, sowohl im Wildtyp als auch in atg1, beobachtet werden. Allerdings war nur im Deletionsstamm die Anreicherung signifikant. Während des Hungerns konnten keine Unterschiede im Proteinlevel festgestellt werden. Da die Expression von GFP-Atg8 durch einen endogenen ATG8-Promotor kontrolliert wurde, liegt die Vermutung nahe, dass die Anwesenheit von TDP-43 die Transkription autophagischer Gene zu einem Zeitpunkt induziert, in der normalerweise kaum Autophagie stattfindet.

Abb. 23: Bestimmung der Autophagierate mit Hilfe der Prozessierung von GFP-Atg8 zu GFP. (A) Die wildtypischen und atg1 Zellen, welche neben dem GFP-Atg8-codierenden Konstrukt ein Doxycyclin-regulierbares Kontroll- oder TDP-43-codierendes Plasmid enthielten, wurden nach ca. 16 Stunden im Expressions-medium (SMGalRD) und nach mehreren Stunden im Hungermedium (SD-N) geerntet. Während bei

atg1 keine GFP-Freisetzung nachgewiesen werden konnte, zeigte der Wildtyp bei beiden inen

(A)

(B)

Abb. 24: Bestimmung des GFP-Atg8-Levels im (A) Wildtyp und (B) atg1-Stamm. Während der Kultivierung im nährstoffreichen Medium (SMGalRD) konnte bei beiden Stämmen eine Zunahme des GFP-Atg8-Levels bei der Expression von TDP-43 beobachtet werden. Bei atg1 war diese signifikant.

Im Hungerzustand (SD-N) war sowohl beim wt, als auch bei der Deletionsmutante kein Unterschied zwischen den Zellen mit Kontrollplasmid und TDP-43-exprimierenden Zellen hinsichtlich des GFP-Atg8-Levels erkennbar. Auf Grund des endogenen Promotors des für GFP-Atg8-codierenden Konstrukts kann vermutet werden, dass die Expression von TDP-43 frühzeitig die Autophagie induziert. Der Mittelwert berechnete sich aus fünf biologischen Klonen aus drei unabhängigen Experimenten. Standardfehler; Mann-Whitney Rank Sum Test: p-Werte: *p<0,05, **p<0,01 und

***p<0,001.

In einem zweiten experimentellen Ansatz sollten die Resultate aus dem GFP-Atg8-Prozessierungsassays überprüft werden. Hierfür wurde die Lipidierung von Atg8 zu Atg8-PE untersucht. Die Konjugation von Atg8 ist ein essentielles Ereignis in der Reifung eines Autophagosoms. Hierbei wird Atg8 mit Hilfe der Atg-Proteine 4, 7 und 3 sowie durch den Atg12-Atg5-Atg16 E3-Komplex mit Phosphatidylethanolamin (PE) verknüpft und in die Phagophore eingebaut. Während die Abspaltung von GFP im GFP-Atg8-Versuch erst in der Vakuole stattfindet, ist das Einbinden von Atg8-PE in die Lipiddoppelmembranen ein früh stattfindendes Autophagieereignis (Abb. 22, Kirisako et al. 1999, 2000, Huang et al. 2000, Nair et al. 2012). Die Lipidierung von Atg8 mit PE wurde im Rahmen dieser Arbeit in einem Wildtypstamm und in einer Negativkontrolle (atg3) mittels Western Blot untersucht. Der Stamm atg3 ist nicht in der Lage Atg8-PE zu synthetisieren. Für das Experiment erfolgte die Transformation beider Stämme mit einem Kontroll- bzw. TDP-43-codierenden Plasmid (pCM190) und einem HA-Atg8-codierenden Konstrukt (siehe Abschnitt 3.7). Das Atg8-PE-Level wurde unter nährstoffreichen (SMGalRD-Ura-Leu) und nährstoffarmen (SD-N) Bedingungen bestimmt (Abb. 25).

Mit Hilfe des Western Blots konnte eine Atg8-Lipidierung sowohl in ungehungerten, frühstationären als auch in gehungerten Wildtypzellen beobachtet werden. Erwartungsgemäß war kein Atg8-PE im atg3-Stamm nachweisbar. Ferner kam es zu keiner sichtbar

(A) (B)

gesteigerten Prozessierung von Atg8 während der TDP-43-Expression im Wildtyp. Eine Quantifizierung der Banden war auf Grund deren Nähe im Western Blot nicht möglich.

Die bisherigen Ergebnisse zeigten, dass das neurotoxische Protein TDP-43 keinen Einfluss auf die Lipidierung von Atg8 hat. Allerdings konnte eine frühzeitige Induktion der Autophagie und eine Steigerung des autophagischen Flusses beobachtet werden. Die Expression von TDP-43 verstärkte demnach den autophagischen Prozess.

Atg8-PE festgestellt. Diese Prozessierung erfolgte bei Zellen mit einem Kontrollplasmid und einem TDP-43-codierenden Konstrukt. Ein optischer Unterschied im Grad der Atg8-Lipidierung war bei den Plasmiden nicht ersichtlich. Als Ladekontrolle diente die Hexokinase.