unkontrolliert in das Zytoplasma exportiert werden
Unter normalen Wachstumsbedingungen wird die poly(A)+RNA an verschiedene Adaptorproteine gebunden, die wiederum mit dem heterodimeren mRNA-Exportrezeptor Mex67-Mtr2 interagieren und so die mRNAs in das Zytoplasma exportieren. Doch bei Stress dissoziieren die mRNA-Adaptoren Npl3, Nab2, Gbp2 und Hrb1 im Zellkern von der poly(A)+RNA und fungieren nicht als Exportfaktoren (Abbildung 21). Nun stellt sich die Frage warum die Adaptorproteine dennoch wichtig für den Transport von regulären Transkripten aus dem Zellkern in das Zytoplasma sind, wenn doch Mex67 direkt RNA binden kann (Abbildung 28). Für Gbp2 und Hrb1 konnte bereits eine Funktion in der mRNA-Qualitätskontrolle von gespleißten mRNAs gezeigt werden (Hackmann et al., 2014).
Es wurde ein Modell vorgeschlagen, nachdem Gbp2 und Hrb1 beispielsweise Mtr4, die ATP-abhängige RNA-Helikase des TRAMP-Komplexes, an die ungespleißte prä-mRNAs rekrutieren. Somit wird die prä-mRNA auf Prozessierung und vollständiges Spleißen hin kontrolliert und ob das Intron korrekt entfernt wurde. Ist dies nicht der Fall, werden die entstandenen prä-mRNAs durch das nukleäre Exosom abgebaut. Sind die Transkripte jedoch korrekt und können exportiert werden, dissoziiert Mtr4 wieder und Mex67 bindet an die Adaptorproteine Gbp2 und Hrb1 (Hackmann et al., 2014).
Um zu untersuchen, ob die mRNA-Qualitätskontrolle auch während Stress aktiv ist, sollen FISH Experimente mit spezifischen Sonden gegen SSA4 und HSP12 durchgeführt werden.
Dabei soll untersucht werden, ob falsche und nicht-prozessierte Stress-spezifische mRNAs bei Hitzestress im Zellkern akkumulieren. Dafür wurden Mutanten der mRNA-Qualitätskontrolle (mtr4-G677D) sowie eine nukleäre Exosommutante rrp6Δ verwendet.
Neben den genannten Mutanten wurden Wildtypzellen und die temperatur-sensitiven exportdefekten Mutanten mex67-5 und mtr2-21 als Kontrolle verwendet. Eine Cy3-gekoppelte Oligo dT(50) Sonde diente als interne Kontrolle, um die Zellkernakkumulation von poly(A)+RNA während Hitzestress zu zeigen (Abbildung 35).
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Abbildung 35: Der Export der SSA4-mRNA und der HSP12-mRNA ist in den Mutanten des TRAMP-Komplexes oder des nukleären Exosoms nicht beeinträchtigt. In FISH Experimenten wurden Wildtypzellen, mex67-5, mtr2-21, mtr4-G677D und rrp6Δ Zellen nach Hitzestress bei 42°C für 30 min fixiert, und mit der DIG-markierten a, SSA4-mRNA oder b, HSP12-mRNA gegen eine FITC-Sonde (grün) und einer Cy3-gekoppelten Oligo-dT(50)-Sonde (rot) hybridisiert. Im „overlay“ ist das grün-fluoreszierende FITC-Signal mit dem blau-fluoreszierenden Hoechst Signal der DNA überlagert.
Wie in Abbildung 35 gezeigt wird, akkumuliert die poly(A)+RNA im Zellkern nach einem 30-minütigen Hitzestress in allen Hefestämmen. Die Stress-spezifischen mRNAs SSA4 und HSP12 zeigen in den exportdefekten Mutanten mex67-5 und mtr2-21 eine deutliche Akkumulation im Zellkern (Abbildung 35). Doch in den Mutanten mtr4-G6777D und rrp6Δ kann man keine Akkumulation der Stress-spezifischen mRNAs im Zellkern erkennen.
Ähnlich wie im Wildtypstamm kann man ein deutliches Signal der untersuchten mRNAs im Zytoplasma detektieren. Das bedeutet, dass keine Stress-spezifischen mRNAs im Zellkern akkumulieren und vermutlich alle entstandenen Transkripte in das Zytoplasma transportiert werden. In Abbildung 35 wurde der Hitzestress für dreißig Minuten durchgeführt. Diese Zeit ist eventuell nicht ausreichend um eine sichtbare Akkumulation der falschen oder nicht-prozessierten Stress-spezifischen Transkripte zu detektieren. Aus diesem Grund wurde das FISH Experiment für eine Stunde wiederholt und in Abbildung 36 dargestellt.
Ergebnisse
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Abbildung 36: Die Stress-spezifischen Transkripte SSA4 und HSP12 werden unabhängig von der Dauer des Hitzestresses und unabhängig von Mtr4 und Rrp6 ins Zytoplasma exportiert. FISH Experimente zeigen Wildtypzellen, die export-defekten Mutanten mex67-5 und mtr2-21 sowie mtr4-G677D und rrp6Δ, die mit Cy3-gekoppelter Oligo dT(50) Sonde (rot) und DIG-gekoppelter a, SSA4-mRNA oder b, HSP12-mRNA Sonde (grün) hybridisiert wurden. Die Zellen wurden für 1 h bei 42°C hitzegestresst. Der „overlay“ zeigt die Überlagerung des FITC Signals mit dem Hoechst Signal (DNA). C, Das Diagramm stellt den prozentualen Anteil der Zellen mit einem Zellkernsignal der poly(A)+RNA (rot) und der SSA4 mRNA (grün) dar. Es wurden mindestens 100 Zellen pro Bedingung gezählt.
Auch nach einer Stunde Hitzestress zeigen die untersuchten Mutanten der mRNA-Qualitätskontrolle mtr4-G677D und die nukleären Exosommutante rrp6Δ keine Akkumulation der Stress-spezifischen Transkripte SSA4 und HSP12 im Zellkern (Abbildung 36). Im Vergleich dazu kann man wiederum ein eindeutiges Zellkernsignal für die poly(A)+RNA in allen gezeigten Hefestämmen feststellen. Nach Quantifizierung des Zellkernsignals der SSA4-mRNA zeigen 50 % bis 60% der Zellen in den Exportmutanten eine Anreicherung des Signals im Zellkern, während mtr4-G677D und rrp6Δ keine Anreicherung des FITC-Signals im Zellkern zeigen (Abbildung 36c). Das weist darauf hin, dass keine Akkumulation von falschen Transkripten im Zellkern nach Hitzestress stattfindet.
Im Unterschied dazu findet unter normalen Wachstumsbedingungen während der Beladung der mRNA mit den Adaptorproteinen eine Überprüfung der reifenden mRNA statt. Bei Deletion der Adaptoren findet keine Akkumulation der mRNA statt, sondern vielmehr ein
„Auslaufen“ von nicht-prozessierten RNAs in das Zytoplasma (Hackmann et al., 2014).
130 Die Deletion des RRP6 Genes hat eine Akkumulation von falschen Transkripten im Zellkern zur Folge und es kommt dadurch zur poly(A)+RNA Anreicherung im Zellkern. Doch die zusätzliche Deletion der mRNA Adaptoren NPL3, NAB2, GBP2 und HRB1 führt zu einer signifikanten Verringerung des poly(A)+RNA Signals im Zellkern (Zander et. al., in Revision). Das weist darauf hin, dass mehr RNAs in das Zytoplasma entlassen werden, die normalerweise durch die Adaptoren im Zellkern festgehalten werden.