Die Kontrolle der Genexpression bei der Stressantwort

Die optimalen Wachstumsbedingungen von S. cerevisiae liegen in einem relativ eingeschränkten Bereich. Bei einer Temperatur von 25°C bis 30°C wachsen die Zellen problemlos (Morano et al., 2012). Allerdings muss die Zelle auch in der Lage sein, moderate Abweichungen wie Temperaturänderungen, pH-Veränderungen oder schwankende Osmolarität zu tolerieren (Bond, 2006). Dabei kann es zur Zerstörung von makromolekularen Komplexen oder zur Falschfaltung von Proteinen kommen. Die Zellen reagieren auf den umgebungsbedingten Stress durch Expression von Stress-spezifischen Genen. Diese Gene werden als Hitzeschockgene bezeichnet und codieren für die Hitzeschockproteine (Hsps) (Bond, 2006). Bei Temperaturen ab 37°C startet die Zelle ein schützendes Trankriptionsprogramm, das man als Hitzeschock-Antwort bezeichnet.

S. cerevisiae kann kurzfristig bis zu einer Temperatur von 42°C wachsen, ist aber nicht in der Lage, diese Temperaturen lange zu verkraften, da auch die RNA-Polymerase II bei andauerndem Hitzestress inaktiviert wird (Yamamoto et al., 2008).

Einleitung

27 In Eukaryoten ist die Proteinfamilie der Hitzeschock-Transkriptionsfaktoren ein entscheidender Modulator für die Stressantwort. In S. cerevisiae gibt es die Transkriptionsfaktoren Hsf1, Msn2 und Msn4, die für die Hitzeschockgenexpression essentiell sind. Das Msn2/4 Regulon wird nicht nur bei einem Hitzestress, sondern auch anderen Stressarten aktiviert. Deshalb wird es als „Enviromental stress response“ (ESR) bezeichnet.

1.5.1.1 Msn2/4:

Msn2 und dessen homologes Protein Msn4 wurden Mitte der neunziger Jahre als Proteine identifiziert, die unter verschiedenen Stressbedingungen für die Expression von einer relativ großen Anzahl an Genen verantwortlich, aber nicht für das Überleben unter normalen Wachstumsbedingungen notwendig sind (Martínez-Pastor et al., 1996; Schmitt und McEntee, 1996). Die Erkennungssequenz für Msn2/4 befindet sich im Promotorbereich des jeweiligen Genes und wurde bereits in Wieser et al. (1991) beschrieben. Sie besteht aus einer pentameren Sequenz, dem CCCCT. Diese Erkennungssequenz wird als „stress responsive element“ (STRE) bezeichnet. Msn2/4 bindet an die STREs und induziert dadurch die Transkription verschiedener Gene in unterschiedlichen Stresssituationen (Martínez-Pastor et al., 1996). Msn2/4 Zielgene werden z. B. nach einem Hitzestress, einem oxidativen Stress oder in der späten stationären Phase induziert (Trott und Morano, 2003)

Abbildung 9: Regulationsmechanismen der Transkriptionsfaktoren Msn2/4 und Hsf1. Die Regulation von Msn2/4 und Hsf1 ist grafisch dargestellt. Msn2/4 wird während des Stresses durch die Proteinphosphatase PP1 dephosphoryliert und lokalisiert dadurch in den Zellkern, wo es an die Stress-spezifischen Elemente (STREs) in den Pomotorbereichen bindet und die Expression von Zielgenen anschaltet. Hsf1 dagegen ist grundlegend im Zellkern lokalisiert und bindet an Zielgene, die Hitzeschockelemente (HSEs) in ihren Promotoren enthalten. Durch die Regulierung der Kinasen Snf1 und Yak1 wird Hsf1 phosphoryliert und dadurch aktiviert. Das Modell wurde modifiziert nach (Morano et al., 2012).

28 Unter normalen Wachstumsbedingungen übernimmt der Signalweg der zyklischen-AMP (cAMP)- Proteinkinase-A (PKA) die transkriptionale Kontrolle und phosphoryliert Msn2/4.

Durch die Phosphorylierungen ist der Transkriptionsfaktor im Zytoplasma lokalisiert und es kann dementsprechend eine Zielgenaktivierung verhindert werden (Görner et al., 1998;

De Wever et al., 2005). Bei Stress dephosphoryliert die Proteinphosphatase PP1 hingegen die PKA- und Snf1 abhängigen Phosphorylierungen von Msn2 (Abbildung 9) (Lenssen et al., 2004; Mayordomo et al., 2002; De Wever et al., 2005). Weiterhin kann PP1 durch die Dephosphorylierung der Proteinkinase Snf1 diese negativ regulieren, verhindert dadurch die Phosphorylierung von Msn2 (De Wever et al., 2005) und verwendet somit zwei verschiedene Wege um die Aktivität von Msn2 zu kontrollieren (Abbildung 9). Durch die Dephosphorylierung von Msn2 bei kurzzeitigem Stress gelangt das Regulon Msn2/4 sofort in den Zellkern (Jacquet et al., 2003). Dieser Transport läuft schnell ab und verursacht die sofortige Expression der Stress-spezifischen Gene.

Lang andauernder Stress führt jedoch zum Abbau von Msn2 und Msn4 im Zellkern, um eine chronische Aktivierung der Zielgene zu verhindern und potentielle Adaptionsmechansimen zu unterbinden (Lallet et al., 2004).

Die, in Abbildung 9 dargestellte Proteinkinase Yak1 phosphoryliert bei geringen Glukosebedingungen Msn2, Msn4 und Hsf1 und ist somit eines der wenigen Proteine, das alle drei Transkriptionsfaktoren gleichzeitig beeinflussen kann (Griffioen et al., 2001; Lallet et al., 2004; Lee et al., 2008).

1.5.1.2 Hsf1

In S. cerevisiae wird der Hitzeschock-Transkriptionsfaktor durch das HSF1 Gen codiert, das auch unter normalen Wachstumsbedingungen für das Überleben der Zelle essentiell ist. Die Transkription der Zielgene von Hsf1 führt zur Synthese von unterschiedlichen Proteinen, die in der Proteinfaltung, im Abbau, in der Entgiftung, in der Energiegewinnung, im Kohlenhydratmetabolismus und in der Zellwandorganisation eine Rolle spielen (Hahn und Thiele, 2004; Yamamoto et al., 2005). In Säugetieren besteht der Transkriptionsaktivator aus vier verschiedenen Isoformen. Dabei reguliert HSF1 primär die Hitzestressantwort, während HSF2 eine Rolle in der embryonalen Genexpression spielt. Die Funktionen von HSF3 und HSF4 sind derzeit noch nicht genau bekannt, aber es wird vermutet, dass sie mit HSF1 interagieren und dadurch die Genexpression regulieren (Akerfelt et al., 2010).

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Abbildung 10: Der Aufbau und der Regulierungsmechanismus von Hsf1. Eingezeichnet sind die relevanten Domänen des Transkriptionsfaktors Hsf1. Die rot-gestrichelten Linien zeigen die regulatorische Verbindung zwischen der NTA (N-terminalen Aktivierungsdomäne in grün) und der CE2 (Kontrollelement 2)/RD (regulatorischen Domäne in lila) bezogen auf die CTA (C-terminale Aktivierungsdomäne in türkis). Die Serin-reiche Region innerhalb der RD wird durch unbekannte Proteinkinasen phosphoryliert, wodurch die Aktivierung der CTA unterdrückt wird. Die NTA unterstützt die transiente Transkriptionsaktivierung, während die CTA für die kontinuierliche Aktivierung verantwortlich ist.

DBD bezeichnet die DNA-Bindedomäne (orange) und die Leucinzipper-Sequenz ist in rot dargestellt. Hsf1 besitzt 833 Aminosäuren und P entspricht den Phosphorylierungen in der CE2-Domäne. Modell nach (Verghese et al., 2012).

Die beschriebenen Strukturelemente des Transkriptionsfaktores sind hoch konserviert (Abbildung 10). Sie beinhalten N-terminal eine Hefe-spezifische Sequenz mit 150 Aminosäuren (Sorger, 1990), eine Helix-turn-Helix DNA-Bindedomäne (DBD), flankiert von einem Leucinzipper-Motif, welches für die Trimerisierung und die Aktivierung wichtig ist. Anschließend folgt eine lose definierte Serin-reiche regulatorische Domäne (CE2/RD) und C-terminal schließt sich die transkriptionale Aktivierungsdomäne an (Trott und Morano, 2003).

Hsf1 kann mit einem pentamerischen Hitzeschockelement (HSE), definiert als perfekt-wiederholende Erkennungssequenz (nTTCnnGAAnnTTCn), in der Promotorregion des induzierenden Genes interagieren (Sorger und Pelham, 1987). Daraus ergibt sich, dass Hsf1 die DNA als Trimer binden kann (Sorger und Pelham, 1987). Diese Erkennungssequenz kann aber auch in ihren Abständen variieren. So konnte durch die Bindung an das Metallothionin-Gen CUP1 gezeigt werden, dass Hsf1 in Folge von Hitzestress und oxidativen Stress auch untypische Wiederholung der HSE binden kann.

Diese untypische Wiederholung der HSE setzt sich aus zwei nGAAn-Wiederholungen mit einem pentameren Spacer und darauffolgend einem weiteren Element zusammen (Liu und Thiele, 1996; Tamai et al., 1994). Auch in vitro DNase I „footprint“ Analysen zeigten, dass Hsf1 verschiedene Varianten der untypischen HSEs binden kann (Yamamoto et al., 2005).

Der Aufbau der HSE-Wiederholungen bestimmt das Verhalten und die Bindung von Hsf1 dramatisch. Für die Bindung eines untypischen HSEs mit 5 Basenpaaren „Spacer“ zwischen den nGAAn-Sequenzen darf Hsf1 weder phosphoryliert noch oligomerisiert vorliegen

30 (Hashikawa et al., 2006). Phosphorylierungen begünstigen Protein-Proteininteraktionen bewirken eine Konformationsänderung der DBD-Domäne, was zu eine Deaktivierung von Hsf1 führt (Hashikawa et al., 2006). Darüber hinaus zeigt die C-terminale regulatorische Domäne von Hsf1, dass diese als Trimer nur perfekte HSE-Sequenzen, nicht aber an untypische HSE-Sequenzen binden kann (Hashikawa et al., 2006). Dies zeigt, wie vielschichtig die Bindung von Hsf1 an seine Zielgene ist und das viele Gene durch Hsf1 aktiviert werden können.