Die Pilzsammlung aus Vietnam und deren enzymatisches Potential

Neben der Nutzbarkeit für mögliche antifungale Wirkstoffe werden Pilze auch aufgrund ihrer sekretierten Biomasse abbauenden Enzyme, wie Cellulasen, Xylanasen, Chitinasen und Lipasen, in der Biotechnologie eingesetzt. Für eine optimierte Anwendung in der Biotechnologie sind effiziente Enzyme, mit einer höheren Umsetzungsrate, einer höheren Stabilität oder auch Enzyme, die unter unterschiedlichen Bedingungen aktiv sind, interessant.

Um die wichtigsten Zersetzer von Cellulose, Xylan, Chitin und Lipide zu identifizieren, wurden neun Habitate ausgewählt, in denen man Pilzisolate mit dieser enzymatischen Aktivität aufgrund des gegebenen Substrates vermutete. Die Anzahl der gesammelten Isolate variiert pro Habitat. Die unterschiedliche Anzahl an gesammelten Pilzisolaten pro Habitat lässt keine Korrelation zwischen den gefundenen Arten und deren Habitat zu. Die gesammelten Pilzisolate geben einen Überblick über das Gattungsspektrum im jeweiligen Habitat. Von 295 gesammelten Pilzisolaten zeigten dabei 211 einen phänotypischen Unterschied. Um eine erste Vorauswahl von enzymatisch aktiven Pilzen aus den 211 Pilzisolaten zu treffen, wurde die Disc Diffusion Methode [Bauer et al. 1966]

angewendet. Diese Methode ist ursprünglich für die antimikrobielle Untersuchung von Bakterien entwickelt worden. In dieser Arbeit wurde eine modifizierte Methode als enzymatischer Plattentest etabliert. Während bei der ursprünglichen Anwendung dieses Tests Bakterien auf Antibiotika getestet wurden, konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass vom Pilz sekretierte Enzyme das im Agar enthaltene Substrat abbauen. Durch eine Färbung der langkettigen Zucker konnte die Abbaurate des Substrates bestimmt werden.

Diese einfach anzuwendende Methode gab einen ersten Überblick über die enzymatische Aktivität der Pilzisolate.

59 Nach dem qualitativen enzymatischen Aktivitätstest nach der Disc Diffusion Methode, konnten 168 Pilzisolate mit mindestens einer enzymatischen Aktivität der getesteten Enzyme identifiziert werden. Diese 168 Isolate wurden auf der Basis von ITS-Sequenzen taxonomisch eingeordnet. Dafür wurde ein phylogenetischer Baum nach den Kriterien des Maximum Liklihood (ML) und des Maximum Parsimony (MP) [Goker et al. 2011]

berechnet. Mit über 150 Referenzsequenzen aus den Datenbanken Mycobank [Robert et al. 2013] und TrichOKEY 2 [Druzhinina et al. 2005] war es möglich, die Sammlung der 168 phänotypisch unterschiedlichen Pilzisolate phylogenetisch in das Reich der Pilze und in die Untergattung der Ascomycota in Gattungen und Sektionen einzuordnen.

Für die erste Einordnung in das Reich der Pilze was es nicht notwendig, die Pilzisolate auf Artniveau zu bestimmen. Um die Art jedes Pilzisolates zu ermitteln, ist es empfehlenswert, eine multi-gene Phylogenie durchführen [Rintoul et al. 2012]. Dabei werden die Sequenzen der kleinen ribosomale RNA Untereinheit (nrSU) und der großen ribosomale RNA Untereinheit (nrLSU) sowie die ITS Sequenz (ITS1, 5,8S Gen, ITS2) zur Einordnung einbezogen. Außerdem werden die Sequenzen des β-Tubulin Gens, der Elongations Faktor 1α (EF-1α), die Untereinheiten der RNA Polymerase II (RPB1 und RPB2) und die Untereinheit 6 der mitochondrialen ATP Synthase (mtATP6) ausgewertet [Sung et al. 2007;

Spatafora et al. 2006]. Alle Markersequenzen werden analysiert und die Art bestimmt. Die ITS Sequenz allein ist für eine genaue Artbestimmung dagegen nicht ausreichend.

Ausgewählte Pilze mit herausragenden enzymatischen Aktivitäten wurden im Laufe dieser Arbeit de novo sequenziert und phylogenetisch genauestens bestimmt.

Die meisten Pilzisolate konnten den Gattungen Aspergillus, Penicillium, Trichoderma und Fusarium der Ascomycota zuordnet werden. Vertreter dieser Gattungen kommen in den meisten Habitaten weltweit vor [Jaklitsch und Voglmayr 2015; Samson et al. 2014;

Visagie et al. 2014; Lombard et al. 2015]. Die dominante Verbreitung dieser vier Gattungen wurde schon in anderen Pilzsammlungen beobachtet [Ja’afaru 2013]. Die gesammelten Gattungen mit wenigen Pilzisolaten (<20%) waren Mucor, Rhizopus, Cunninghamella und Gongronella aus der Untergattung der Mucoromycota, und Humicola, Taifanglania, Diaporthe, Lasiodiplodia, Curvularia, Talaromyces, aus der Untergattung Ascomycota. Die Pilzisolate der Gattungen Taifanglania, Lasiodiplodia, Cunninghamella und Gongronella wiesen keine signifikante enzymatische Aktivität bei den in dieser Arbeit getesteten Enzymen auf. Einige Mitglieder dieser Gattungen zeigten jedoch in anderen Arbeiten eine leichte Aktivität als Zersetzer von Cellulose, Xylan und Fettsäuren [Latha 2013;

Gopinath et al. 2002].

60 Generell sind Vertreter der Gattung Trichoderma hauptsächlich auf Pflanzenmaterial, im Boden und auf abgestorbenem Holz zu finden [Kredics et al. 2014]. Trichoderma ressei ist der bekannteste und am meisten erforschte Ascomycota der letzten Jahre und wird aufgrund seiner Cellulasen und Xylanasen industriell eingesetzt [Nevalainen et al. 1994]. Das lässt die Tatsache erklären, dass kein Pilzisolat der Gattung Trichoderma in den marinen Habitaten (Garnelenschalen / Krabbenschalen) gefunden wurde. Die für ihr Wachstum notwendigen kohlenstoffhaltigen Substrate sind in marinen Habitaten nicht zu finden. Man kann spekulieren, dass die Gattung Trichoderma ein spezifischeres Substratspektrum aufweist als die Gattung Aspergillus, welche in allen neun Habitaten gefunden wurde. Die Gattung Aspergillus mit ihren 22 Sektionen und mehr als 250 Arten ist ubiquitär auf der ganzen Welt vertreten [Geiser et al. 2008]. Die gesammelten Gattungen Penicillium und Fusarium stammen von den Habitaten Mangrovenwald, Bodenoberfläche, dem Ölhaltigen Habitat und den Marinen Habitaten (Garnelenschalen und Krabbenschalen) sowie von Insektenkörpern.

Beide Gattungen gelten ebenfalls zu den weit verbreitetsten Pilzen weltweit.

Es konnte gezeigt werden, dass ein breites Spektrum an unterschiedlichen Gattungen in der gesammelten Pilzsammlung aus neun Habitaten in Vietnam gesammelt werden konnte. Dies bestätigt die beschriebene Biodiversität in Vietnam. Außerdem wurde gezeigt, dass die unterschiedlichen Pilzisolate je nach Gattung in ihrem beschriebenen Verbreitungsgebiet vorkommen. Allerdings lässt die unterschiedliche Anzahl an gesammelten Pilzisolaten pro Habitat keine Korrelation zwischen den gefundenen Arten und deren Habitat zu. Sie gibt einen Einblick in die pilzliche Diversität in Vietnam und deren Habitate. Alle Pilzisolate der Sammlung wurden auf ihre Enzymaktivität hin untersucht und entsprechend der untersuchten Enzyme Chitinase, Cellulase, Xylanase und Lipase analysiert.

3.2.1 Chitinasen in der Pilzsammlung

Chitinasen hydrolysieren das Biopolymer Chitin und werden für viele biotechnologische Prozesse eingesetzt (siehe Einleitung 1.4.3). Durch ihre Fähigkeit, pilzliche Zellwände sowie das Exoskelett von Insekten zu zersetzen, werden sie zur Bekämpfung von mikrobiellen Pflanzenpathogen oder als Insektizid eingesetzt [Roberts und Selitrennikoff 1988; Kramer und Muthukrishnan 1997]. Sie zersetzen zudem Chitin zu pharmazeutisch aktiven Produkten wie N-Acetyl-D-Glucosamin und Chito-Oligosacchariden, die eine Tumor inhibitorische Wirkung besitzen [Aam et al. 2010; Shen et al. 2009].

Aus dem Habitat Garnelenschalen wurden zwei Arten mit hoher Chitinaseaktivität, Fsh101 (Aspergillus Sektion Nidulans) und Fsh6 (Fusarium) isoliert. Das Isolat Fsh101 weist eine

61 Chitinaseaktivität von 0,13 U/mg auf. Diese Aktivität ist in etwa vergleichbar mit der Chitinaseaktivität von 0,24 U/mg von Aspergillus nidulans [Reyes et al. 1989] bei einem verwendete Kulturüberstand von 1000 mL, im Gegensatz zu den in dieser Arbeit verwendeten Kulturüberstand von 10 mL. Es war nicht zu erwarten, dass weitere vier Pilzisolate, FW57, FW35, SF7 und FF1, der Gattungen Humicola, Aspergillus Sektion Fumigati und Aspergillus Sektion Flavi, mit einer ähnlich hohen Chitinaseaktivität aus den Habitaten Bodenoberfläche, Mangrovenwald und Früchte isoliert wurde.

Isolierte und charakterisierte Chitinasen der Gattungen Aspergillus, Penicillium und Fusarium wurden bereits beschrieben [Duo-Chuan 2006; Karthik et al. 2014; Silva et al.

2011]. Aufgrund der ubiquitären Verbreitung dieser Gattungen haben sie ein breites enzymatisches Spektrum. Obwohl bei Arten aus der Gattung Trichoderma Chitinasen mit hoher enzymatischer Aktivität beschrieben wurden [Duo-Chuan 2006; Karthik et al. 2014], konnte in der Pilzsammlung aus Vietnam kein Isolat der Gattung Trichoderma mit Chitinaseaktivität charakterisiert werden. Die Gattung Trichoderma ist in den chitinhaltigen Habitaten Krabbenschalen und Garnelenschalen mit nur 6,7% unterrepräsentiert. In den Habitaten Mangrovenwald und Bodenoberfläche ist Trichoderma mit 27% bzw. 27,3%

häufiger vertreten. Eine solche Häufigkeit wurde auch in anderen Studien dokumentiert [Druzhinina et al. 2012].

3.2.2 Cellulasen in der Pilzsammlung

Cellulasen werden hauptsächlich in der Nahrungs- und Futtermittelindustrie, in der Textilindustrie sowie bei der Vorbehandlung bei der Second Generation Bioethanol Produktion eingesetzt [Arja 2007; Gamage et al. 2010; Kuhad et al. 2011; Mai et al. 2004].

Durch die Verwendung von lignocellulytischer Biomasse beim Second Generation Bioethanol besteht das Problem, dass die verwertbaren Zucker in der Biomasse eingeschlossen sind und durch eine Vorbehandlung gelöst werden müssen. Obwohl die Vorbehandlung von Biomasse auch durch chemische sowie physikalische Verfahren erfolgen kann, wie beispielsweise die Säure-Vorbehandlung mit verdünnter Schwefelsäure oder Phosphorsäure [Israilides et al. 1978; Nguyen et al. 2000], ist die biologische Vorbehandlung durch Enzyme kostengünstiger, schneller und umweltfreundlicher [Kumar und Wyman 2009; Kumar und Sharma 2017; Sánchez 2009]. Um die chemischen und physikalischen Vorbehandlungen zu umgehen, ist die Suche nach leistungsstarken Cellulasen von besonderem Interesse [Srivastava et al. 2018].

62 Die Pilzisolate Fsh13 (Fusarium sp.), FW16.1 (Fusarium sp.) und SF31 (Aspergillus Sektion Terrei sp.) zeigten die höchste Cellulaseaktivität der Pilzsammlung mit 0,05 bis 0,09 U/mg. Viele Arten der Gattungen Fusarium und Aspergillus sind Pflanzenpathogene und gelten als Produzenten von aktiven sekretierten Cellulasen [Kwon et al. 2007]. Cellulasen sind, wie andere Zellwand abbauenden Enzyme, Xylanasen und Endo-Polygalacturonase, beschrieben als mögliche Virulenzfaktoren bei der Infektion von pflanzenpathogenen Pilzen [Cooper et al. 1988; Paccanaro et al. 2017]. Betrachtet man die Habitate, in denen Pilzisolate mit einer Cellulaseaktivität gefunden wurden, so fällt auf, dass eine große Anzahl an Pilzen mit dieser Aktivität in den Habitaten Mangrovenwald und Bodenoberfläche gefunden wurde. Diese Verteilung war aufgrund der Zellwand abbauenden Aktivität zu erwarten. Es scheint zunächst unverständlich, dass auch Pilzisolate mit Cellulaseaktivität in den Habitaten Garnelenschalen und Insektenkörper gefunden wurden, wenngleich mit geringer Anzahl. Dieses Vorkommen weist auf eine promiskuitive

-Glucuronidaseaktivität hin, welche Cellulose abbauen kann [O’Brien und Herschlag 1999; Khersonsky und Tawfik 2010]. Extrazelluläre Cellulasen von Fusarium oxysporum und Aspergillus terreus wurden mit einer Aktivität von etwa 0,5 bis 0,9 U/mg beschrieben. Die Höhe der Aktivität ist von der verwendeten Substratkonzentration abhängig [Abdel-Fatah et al. 2012; Mirzaakhmedov et al. 2007;

Dar et al. 2013]. Im Gegensatz zu den beschriebenen aktiven Cellulasen der Gattung Trichoderma [Bischof et al. 2016; Schuster und Schmoll 2010] konnte jedoch innerhalb dieser Studie keine hohe Cellulaseaktivität der Gattung Trichoderma detektiert werden.

3.2.3 Xylanasen in der Pilzsammlung

Neben der Produktion von Biokraftstoffen werden Xylanasen bei biotechnologische Prozesse wie der Nahrung- und Futterindustrie sowie der Bioethanolproduktion verwendet [Beg et al. 2001; Nagar et al. 2012; Sultan et al. 2008]. Die Pilzisolate mit einer nachweislichen Xylanaseaktivität sind ähnlich verbreitet wie die Pilzisolate mit einer Cellulaseaktivität. Dies war zu erwarten, da Cellulasen sowie Xylanasen synergistisch die Pflanzenzellwand von organischem Material abbauen [Murashima et al. 2003;

Pérez et al. 2002].

Die Pilzisolate Fsh17, FR1 (0,74 U/mg und 0,97 U/mg, Aspergillus Sektion Flavi) und FL100 (1 U/mg, Penicillium Sektion Citrina) weisen eine hohe Xylanaseaktivität auf. Eine spezifische Aktivität von Xylanasen, isoliert aus Aspergillus flavus, wurde mit 0,11 bis 20,40 U/mgbeschrieben [De Alencar Guimaraes et al. 2013]. Für die Aktivität der Xylanase

63 spielt das verwendete Substrat eine erhebliche Rolle. Durch ein anderes Substratspektrum ist es möglich, die Aktivität der Enzyme zu optimieren. Während in dieser Arbeit das Xylan von Buchenholz als Substrat verwendet wurde, wurde in anderen Studien gezeigt, dass die Xylanaseaktivität bei variierendem Substrat erhöht werden kann [De Alencar Guimaraes et al. 2013]. Wie bei der Cellulaseaktivität der Sammlung bereits an früherer Stelle beschrieben, konnte auch keine Xylanaseaktivität von Pilzisolaten der Gattung Trichoderma festgestellt werden. Dies begründet sich mit hoher Wahrscheinlichkeit dadurch, dass die Xylanasen von Trichoderma ihre höchste Aktivität nur durch eine Substratinduktion erreichen [Juhász et al. 2005; Kubicek und Penttilä 1998]. Xylanasen spielen eine große Rolle bei der Infektion von Pflanzen durch pflanzenpathogene Pilze.

Diese wirken oft zusammen mit anderen Zellwand abbauenden Enzymen, um die Pflanzenzellwand der Wirtspflanze abzubauen. Paccanaro et al. [2017] beschrieb, dass die Xylanase (Xyr1) und die Endo-Polygalacturonase (PG1) des phytopathogenen Pilz F. graminearum synergistisch an dem Abbau der Zellwand beteiligt sind und somit ein möglicher Virulenzfaktor ist. Es konnte gezeigt werden, dass die Pilzsammlung einige Pilzisolate mit einer hohen Xylanaseaktivität aufweist.

3.2.4 Lipasen in der Pilzsammlung

Die höchste Lipaseaktivität wurden bei den Pilzisolaten Fusarium sp. Fsh13 (0,14 U/mg) und Aspergillus Sektion Nidulans sp. Fsh102 (0,27 U/mg) gemessen. Diese Werte sind mit der Lipaseaktivität von Fusarium sp. YM-30 von 0,15 U/mg [Mase et al. 1995] und einer Lipase von Aspergillus nidulans mit 0,3 U/mg [Mayordomo et al. 1999] zu vergleichen.

Beide Pilzisolate der Sammlung wurden im Habitat Garnelenschalen isoliert, welches eine erhebliche Menge an hoch molekularen Kohlenwasserstoffen als Substrat für die enzymatische Funktion der Lipase bietet. Die in dieser Arbeit untersuchte Pilzsammlung aus Vietnam beinhaltet einige Ascomycota mit einer hoher Lipaseaktivität. Diese Pilzisolate sind potentielle Kandidaten für verschiedene industrielle Anwendungsgebiete bei denen aktive Lipasen benötigt werden (siehe Einleitung 1.4.4).

Durch den enzymatischen Aktivitätstest der gesamten Pilzsammlung konnte gezeigt werden, dass viele Pilzisolate aus den neun unterschiedlichen Habitaten eine Enzymaktivität der Chitinase, Lipase, Cellulase und Xylanase aufweisen. Allgemein ist festzuhalten, dass die detektierte enzymatische Aktivität der Pilzisolate mit ihren Habitaten übereinstimmt. So findet man in Habitaten mit viel organischer Biomasse Pilzisolate mit Cellulase- und Xylanaseaktivität sowie in marinen Habitaten Pilzisolate mit Chitinaseaktivität. Die

64 Pilzisolate der Gattung Trichoderma konnten nicht mit einer hohen Cellulase- und Xylanaseaktivität detektiert werden.